膵再生誘導による新しい慢性膵炎治療法の開発(骨髄間質細胞から分化誘導した膵外内分泌細胞移植による検討)

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雌性C3H/Heマウスの大腿骨から骨髄細胞を採取した。Dexterの方法に準じてpenicilline, stereptomycin, amphotericin Bを添加した20%FBSを含むIscove's modified Dulbecco's mediumを用いて骨髄細胞の初代培養を行った。14週間後、壁付着細胞をTrypsin/EDTAで分離し、6週間培養し、骨髄間質細胞を得た。その後4ヶ月間継代培養し、不活化した培養株を作製した。不活化した培養株に1,10,50,100μMの5-アザシチジン(分化誘導剤)を添加し、48時間培養し、線維芽様細胞が得られた。引き続き同濃度の5-アザシチジン添加下に28日間あるいは56日間継代培養した後、培養細胞からRNAおよびを蛋白を抽出し、mRNAの発現をノザーンブロット法を用いて蛋白の発現をウエスタンブロット法を用いて検討したが、28日間継代培養群および56日間継代培養群ともに炭酸脱水素酵素mRNAおよび蛋白の発現は認められなかった。不活化した培養株に5-アザシチジンに加え、種々の濃度のTGF-β1あるいはHGFを同時に添加し、上述の方法と同様に培養し検討したが、TGF-β1添加群およびHGF1添加群のいずれにおいても炭酸脱水素酵素mRNAおよび蛋白の発現は認められなかった。さらに、不活化培養株に5-アザシチジン(1,10,50,100μM)およびアクチビンA10,50,100,200ng/mlを同時に添加した群、5-アザシチジンおよびフオリスタチン1,10,50,100,200μMを添加した群、5-アザシチジン、アクチビンAおよびフオリスタチンを添加した群のいずれにおいても炭酸脱水素酵素mRNAおよび蛋白の発現は認められなかった。