肺癌の浸潤・転移におけるADPリボシル化因子6(ARF6)の役割の解明

阐明ADP-核糖基化因子6（ARF6）在肺癌侵袭和转移中的作用

• 批准号: 13770295
• 负责人: 佐田 誠
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Yamagata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13770295/
• 关键词: 肺癌; ADP-ribosylation factor 6 (ARF6); 浸潤; 転移; 細胞運動; ADP-ribosylation factor 6(ARF6)

本年度も,ARF-GEP100 polyclonal抗体を使用しヒト切除肺癌組織および隣接正常肺組織からの抽出蛋白に対してWestern blotにてARF-GEP100の発現状況を調べることを継続しているが,やはり癌組織中での発現が高い傾向が認められている。さらに,我々は現在Human ARF6のC末端側の12アミノ酸(CKLTWLTSNKYS)に対するポリクローナル抗体と,ARF-GEP100の153-176番目のアミノ酸(RARDTEPQTALHGMDHRKLDEMTA)に対するポリクローナル抗体を作製している。また,遺伝子工学的手法を用いてARF6の活性型変異体ARF6(Q67L),不活性型変異体ARF6(T27N)の発現ベクターを作製した。さらに前年度の実験結果をもとに野生型ARF6発現ベクター,上述の変異体発現ベクター,あるいはARF-GEP100, EFA6, ACAP1/2といったARF6調節因子の発現ベクターを肺癌細胞株にトランスフェクションし,ARF6あるいはARF6調節因子の癌細胞株の表現型に与える影響を検討する予定である。具体的には,親株,mock transfectants,上記各種トランスフェクタント,に対して以下の事項につき検討する予定である。(1)細胞増殖能alamarBlue assay法,コロニーフォーメーションアッセイ法にて細胞増殖能の変化を調べる。(2)In vitro invasion assaytranswell chamber法を用いて細胞の浸潤能の変化をin vitroで評価する。(3)細胞形態と細胞内局在の観察Phase-contrast microscopyを用いて細胞形態の変化を観察するとともに,confocal imunofluorescence microscopyにより各蛋白の細胞内局在とactin cytoskeletonの存在様式を観察する。(4)ヌードマウスを使ったin vivoにおける増殖・転移能の検討各種トランスフェクタントをヌードマウス皮下に移植(あるいは尾静脈注入)後,経時的に腫瘍サイズを測定し4〜8週間後に肺表面の転移結節数を数え,転移・増殖能の変化につき検討を加える。また転移・増殖能に変化がみられた場合は,ARF6(Q67L), ARF-GEP100, EFA6のトランスフェクタントにARF6, ARF-GEP100, EFA6のantisense cDNAを各々co-transfectionし同様の検討を行い上記実験で得られた結果の特異性につき評価するとともに治療の標的の可能性についても検討する。

This year,ARF-GEP100 polyclonal antibody was used to remove lung cancer tissue and extract protein from adjacent normal lung tissue, and Western blot was used to modulate the expression of ARF-GEP100. In addition, we have developed antibodies against the C-terminal 12-mer acid (CKLTWLTSNKYS) of Human ARF6 and antibodies against the C-terminal 153-176-mer acid (RARDTEPQTALHGMDHRKLDEMTA) of ARF-GEP100. In addition, the method of genetic engineering was used to control the development of ARF 6(Q67L) and ARF6(T27N). The results of the previous year showed that ARF6 gene expression in wild-type cells was higher than that in ARF-GEP100, EFA6, ACAP1/2 and ARF6 gene expression in lung cancer cell lines. Specific, parent,mock transfectants, note all kinds of special conditions, for the following matters to be discussed. (1)AlamarBlue assay for cell proliferation, cell proliferation and cell transformation (2)In The vitro invasion assaywell chamber method is used to evaluate the transformation of cell infiltration ability in vitro. (3)Phase-contrast microscopy is used to detect the cellular morphology and intracellular distribution of proteins. (4)The number of metastatic nodules on the lung surface was measured 4 to 8 weeks after subcutaneous transplantation (tail vein injection), and the number of metastatic nodules on the lung surface was increased. In this case, ARF6 (Q67L), ARF-GEP100, EFA6 and ARF6 (Q67L) were selected for the analysis of the antisense cDNAs of ARF6, ARF-GEP100, EFA6.

项目成果

Yamaoka-Tojo M et al.: "Dual response to Fas ligation in human endothelial cells : apoptosis and induction of chemokines, interleukin-8 and monocyte chemoattractant protein-1"Coron Artery Dis. 14(1). 89-94 (2003)

Yamaoka-Tojo M 等人：“人内皮细胞对 Fas 连接的双重反应：细胞凋亡和趋化因子、白细胞介素 8 和单核细胞趋化蛋白 1 的诱导”冠状动脉 Dis。