心筋変異アクチンによる心不全の新たな遺伝子治療への基礎的検討

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アクチン遺伝子はpUC119にサブクローニングされている2.1kbのDictyostelium Discoideum Actin15全長遺伝子に対してsite-directed-mutagenesisを行っている。本年度、意図したmutageneが得られず、さまざまな条件を変更し正しいシークンスを得るべく試行錯誤の状況である。まずはLA-PCR(long-accuracy PCR)によって直接mutagenesisを試みたが、伸長段階にてPCRエラーが多発するため、ターゲットのシークエンスをHind III, BglIIにてrestriction cutし、サブフラグメントに対してKunkel法によってmutagenesisを行ってintegrateする方法に変更する。また、PCRのanneal温度をやや低めに設定してあったので、stringencyを確保するためやや高温(68℃→72℃)に変更したり、伸長時間を長めに設定するなど細かい条件設定につき再検討を行っている。シークエンスが得られれば、プロモータとともにexpression vectorに挿入する予定である。本年度は以上のようにターゲット遺伝子を作成する段階での試行錯誤にとどまっており、結果を導くに至っていない。