病的なサイトカイン血症を来す病因関連蛋白質の立体構造解析と新たな治療法の開発

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平成13年度は、リコンビナント蛋白を用いたMyD88の立体構造解析を行うために、ヒトのMyD88発現ベクターの構築を行った。MyD88は36kDほどの大きさがあるため大腸菌を用いた発現系、哺乳類の細胞での発現系では、構造を保ったまま精製を行うのは難しく、困難であった。このため全長を2つのドメインに分けDeath DomainとToll-like Interleukin 1 receptor (TIR) Domainとして発現させるべく発現ベクターの構築をおこなった。いくつかの発現ベクターを構築し、大腸菌での発現量を比較し、高発現量を確保できる発現系について検討を加えた。また、哺乳類細胞における発現系、酵母を用いた発現系についても検討した。さらにそれに加え精製法についても検討している。現在、安定同位体ラベル、大量高純度精製系の確立を行う段階である。これらが確立され次第、15Nラベル体、15N・13Cダブルラベル体を用いて多次元NMR法による各種相関スペクトル解析を行い、そのデータを用いた構造解析に取り組む予定である。また、リガンド・レセプター複合体の構造解析を行うためにIL-18レセプターリコンビナント蛋白の発現についても検討中である。現在までにレセプター蛋白のcDNAをクローニングし、ドメインの一部は発現ベクターを構築している。今後、発現・精製系の確立・最適化を行っていく予定である。その後、リガンドと同様に安定同位体ラベルして蛋白を作成し、同様の手法を用いて解析を行う。