病的なサイトカイン血症を来す病因関連蛋白質の立体構造解析と新たな治療法の開発

引起病理性细胞因子血症的发病机制相关蛋白的三维结构分析及新疗法的开发

• 批准号: 13770392
• 负责人: 折居 建治
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Gifu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13770392/
• 关键词: MyD88; 立体構造解析; Death Domain; TIR Domain

平成13年度は、リコンビナント蛋白を用いたMyD88の立体構造解析を行うために、ヒトのMyD88発現ベクターの構築を行った。MyD88は36kDほどの大きさがあるため大腸菌を用いた発現系、哺乳類の細胞での発現系では、構造を保ったまま精製を行うのは難しく、困難であった。このため全長を2つのドメインに分けDeath DomainとToll-like Interleukin 1 receptor (TIR) Domainとして発現させるべく発現ベクターの構築をおこなった。いくつかの発現ベクターを構築し、大腸菌での発現量を比較し、高発現量を確保できる発現系について検討を加えた。また、哺乳類細胞における発現系、酵母を用いた発現系についても検討した。さらにそれに加え精製法についても検討している。現在、安定同位体ラベル、大量高純度精製系の確立を行う段階である。これらが確立され次第、15Nラベル体、15N・13Cダブルラベル体を用いて多次元NMR法による各種相関スペクトル解析を行い、そのデータを用いた構造解析に取り組む予定である。また、リガンド・レセプター複合体の構造解析を行うためにIL-18レセプターリコンビナント蛋白の発現についても検討中である。現在までにレセプター蛋白のcDNAをクローニングし、ドメインの一部は発現ベクターを構築している。今後、発現・精製系の確立・最適化を行っていく予定である。その後、リガンドと同様に安定同位体ラベルして蛋白を作成し、同様の手法を用いて解析を行う。

In 2013, MyD88 was used to analyze the three-dimensional structure of MyD88, and MyD88 was developed to construct MyD88. MyD88 is a 36kD strain that is difficult to develop in the presence of Escherichia coli, mammalian cells, and to preserve and refine its structure. Death Domain and Toll-like Interleukin 1 receptor (TIR) Domain appear in the structure. The detection of Escherichia coli is relatively high, and the detection of Escherichia coli is ensured. Mammalian cell development system, yeast development system This time, we will add the refined method to the test. At present, stable isotopes, a large number of high-purity purification system to establish the next stage. The order of 15N, 15N, 13C and 15N were determined by multiple element NMR. The structure analysis of IL-18 protein complex was carried out in the middle of the study. Now, the cDNA sequence of the protein has been developed, and part of the protein has been constructed. In the future, development, refinement, establishment, optimization and implementation of the system will be determined. After the separation, the separation and the same stable isotope are prepared, and the same method is used for the analysis.