骨髄性プロトポルフィリン症のferrochelatase遺伝子の分子生物学的解析

髓样原卟啉症亚铁螯合酶基因的分子生物学分析

• 批准号: 13770459
• 负责人: 半仁田 優子
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: University of the Ryukyus
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13770459/
• 关键词: 骨髄性プロトポルフィリン症; Ferrochelatase messenger RNA; EBV tranformedリンパ球

骨髄性プロトポルフィリン症患者における責任酵素であるFerrochelatase活性をそのmessenger RNA発現で検討する。(1)ヒトリンパ球培養条件設定:骨髄性プロトポルフィリン症患者及びその血縁者から提供頂いた血液からリンパ球を分離しEB tranformedし増殖曲線が安定するまで37℃,5%CO2インキュベーターにおいて細胞培養した。リンパ球をトリパンブルー染色にて染色し生細胞を確認した。(2)ヒトリンパ球から全RNA抽出及び逆転写酵素によるcDNA作製:細胞数106個のリンパ球に2ccのRNAzolTMを用いて抽出した(方法はmanufacture protocolに従った。)。抽出したRNAを260nmで吸光度測定し、1OD260=40ng/mlで計算した。アガロースゲルで電気泳動しRNAのうち28Sと18S ribosomal RNAを確認した。cDNA作製は全20ulの反応液中に4ugの全RNAを加え、MMuLV逆転写酵素で反応させた。cDNAの確認はGAPDHをPCR法で増幅しバンドを確認した。(3)Ferrochelatase mRNA定量:骨髄性プロトポルフィリン症患者2名(2家系)、血縁者1名(1家系)、正常検者1名の計4名について検討した。cDNAの希釈系列を作り1x,1/2x,1/4x,1/8x,1/16x,1/32xのcDNAについてFerrochelataseと内部対照としてGAPDHの2つについてPCR法でバンドの発現を比較した。結果は正常検者を1とすると患者の父(W.T)が2,患者(WA;同家系)が2,患者(N.M;別家系)が2という結果を得た。(4)患者2名よりも正常検者の発現が強く,血中プロトポルフィリン値との乖離があるため発現しているFerrochelatase酵素が正常に働いているかどうかを確認する必要がある。

Bone marrow sex プ ロ ト ポ ル フ ィ リ sufferer ン に お け る responsibility enzyme で あ る Ferrochelatase active を そ の messenger RNA 発 で now beg す 検 る. (1) ヒ ト リ ン パ ball culture conditions set: bone marrow sex プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン disease patients and び そ の blood who try か ら provide top い た blood か ら リ ン パ ball を separation し EB tranformed し raised が stable yield curve す る ま で 37 ℃ and 5% CO2 イ ン キ ュ ベ ー タ ー に お い て cell culture し た. Youdaoplaceholder0 パ パ globosphere をトリパ ブ ブ <s:1> にて staining にて staining of germogenic cells を confirmation of た た. (2) ヒ ト リ ン パ ball か ら total RNA extraction and び inverse planning write enzyme に よ る cDNA cropping: cell number 106 の リ ン パ ball に 2 cc の RNAzolTM を with い て spare し た (method は manufacture protocol に 従 っ た.) . Extract <s:1> たRNAを260nmで absorbance to determine <s:1>, 1OD260=40ng/mlで to calculate <s:1> た. Youdaoplaceholder0 アガロ スゲ スゲ スゲ で で electrokinetic embryonic RNA <s:1> うち28Sと18S ribosomal RNAを confirm た た. cDNA preparation: In 20 μ l of <s:1> reverse 応 solution, に4 μ g of <s:1> whole RNAを is added with え and MMuLV reverse 転 writing enzyme で reverse 応させた. cDNA <s:1> confirmation of GAPDHをPCR で increase <s:1> バ ドを ドを confirmation of <s:1> た. (3)Ferrochelatase mRNA quantification: Four patients, including two (from two families) with osteomatous プロトポ に フィリ フィリ フィリ, one (from one family) with hemangioma, and one normal 検, were selected to conduct た た. CDNA の 釈 series を as り 1 x, 1/2 x, 1/4 x, x 1/8, 1/16, x x 1/32 の cDNA に つ い て Ferrochelatase と internal polices according to と し て GAPDH の 2 つ に つ い て PCR method で バ ン ド の 発 を now compare し た. Results は 検 normal person を 1 と す る と の father (W.T) が 2 patients, patients (WA; with the family) が 2, (N.M; another department) in patients with が 2 と い た を う results. 2 (4) in patients with よ り も normal 検 is の 発 が strong く, blood プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン numerical と の stays が あ る た め 発 now し て い る Ferrochelatase enzyme が normal に 働 い て い る か ど う か を confirm す る necessary が あ る.

项目成果

川田暁ほか: "FerrochelataseのmRNAレベルの低下がみられた乳児の骨髄性プロトポロフィリン症"皮膚. 43巻2号. 111-115 (2001)

Akira Kawada 等人：“铁螯合酶 mRNA 水平降低的婴儿的骨髓原疏松症”，Skin，第 43 卷，第 2 期，第 111-115 期（2001 年）。