骨髄性プロトポルフィリン症のferrochelatase遺伝子の分子生物学的解析

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骨髄性プロトポルフィリン症患者における責任酵素であるFerrochelatase活性をそのmessenger RNA発現で検討する。(1)ヒトリンパ球培養条件設定:骨髄性プロトポルフィリン症患者及びその血縁者から提供頂いた血液からリンパ球を分離しEB tranformedし増殖曲線が安定するまで37℃,5%CO2インキュベーターにおいて細胞培養した。リンパ球をトリパンブルー染色にて染色し生細胞を確認した。(2)ヒトリンパ球から全RNA抽出及び逆転写酵素によるcDNA作製:細胞数106個のリンパ球に2ccのRNAzolTMを用いて抽出した(方法はmanufacture protocolに従った。)。抽出したRNAを260nmで吸光度測定し、1OD260=40ng/mlで計算した。アガロースゲルで電気泳動しRNAのうち28Sと18S ribosomal RNAを確認した。cDNA作製は全20ulの反応液中に4ugの全RNAを加え、MMuLV逆転写酵素で反応させた。cDNAの確認はGAPDHをPCR法で増幅しバンドを確認した。(3)Ferrochelatase mRNA定量:骨髄性プロトポルフィリン症患者2名(2家系)、血縁者1名(1家系)、正常検者1名の計4名について検討した。cDNAの希釈系列を作り1x,1/2x,1/4x,1/8x,1/16x,1/32xのcDNAについてFerrochelataseと内部対照としてGAPDHの2つについてPCR法でバンドの発現を比較した。結果は正常検者を1とすると患者の父(W.T)が2,患者(WA;同家系)が2,患者(N.M;別家系)が2という結果を得た。(4)患者2名よりも正常検者の発現が強く,血中プロトポルフィリン値との乖離があるため発現しているFerrochelatase酵素が正常に働いているかどうかを確認する必要がある。