フォンビルブランド因子特異的切断酵素のモノクローナル抗体を用いた精製と構造機能解析

使用单克隆抗体纯化冯维勒布兰德因子特异性裂解酶并进行结构功能分析

• 批准号: 13770583
• 负责人: 松本 雅則
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Nara Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13770583/
• 关键词: フォンビルブランド因子; VWF-CP; ADAMTS13; フォンビルデランド因子; VWF-CPase

フォンビルブランド因子特異的切断酵素(VWF-CP)の精製をFujikawaらの方法をもとに改変し行った。蛋白精製の出発材料は有効期限切れの新鮮凍結血漿(fresh frozenplasma、FFP)である。これをDFPで処理し、その後lysin-sepharoseカラムを通して、まず血漿中のplasminogenを除去した。以後、硫安沈澱、butyl-sepharoseカラム、Q-sepahroseカラム、superdex200カラムにてVWF-CPを部分精製した。これを抗原として、マウスとウサギに免疫し、前者からはモノクローナル抗体を、後者からはポリクローナル抗体を作成した。モノクローナル抗体は、ELISAおよびウエスタンブロットでスクリーニングを行ったが、VWF-CPに特異的に反応するモノクローナル抗体は得られなかった。しかし、ポリクローナル抗体は、ウエスタンブロットでVWF-CPと強く反応し、また酵素活性を阻害することも確認した。阻害力価は、ポリクローナル抗体IgG 1mgあたり8.9 Bethesda Unitであった。なお、1 Betheda UnitはVWF-CP活性を50%阻害する力価である。今後、このポリクローナル抗体を用いVWF-CPを精製するか、遺伝子発現したVWF-CPを用いてマウスにするかして、再度モノクローナル抗体の作成を試みる予定である。

The method of cutting off the enzyme (VWF-CP) of the specific factor (VWF-CP) was used to improve the activity of the factor. The method was modified. There is a period of restriction on the production of albumen, new blood samples (fresh frozenplasma, FFP). Please DFP the doctor, lysin-sepharose the doctor, and remove the plasminogen from the blood. After that, some of the products such as thioamphenicol, butyl-sepharose, Q-sepahrose, superdex200 and VWF-CP were selected. Antigens, antibodies, antibodies. The antibody, the ELISA antibody, the antibody. Antibody, antibody, VWF-CP, enzyme activity, enzyme activity, antibody, antibody, enzyme activity, antibody, antibody, enzyme activity, antibody, enzyme activity, enzyme activity, antibody, enzyme activity, antibody, antibody, The anti-IgG 1mg antibody was detected in the serum of patients with Bethesda Unit infection. The activity of 1 Betheda Unit VWF-CP was 50%, and the activity was 50%, and the activity was 50%. From now on, the VWF-CP antibody will be used to make the predetermined antibody, and the VWF-CP will be made with the antibody antibody again.

项目成果

藤村吉博 他: "血小板血栓形成の分子機構"アイプリコム出版社. 407 (2002)

Yoshihiro Fujimura 等：“血小板血栓形成的分子机制”Ipricom Publishing 407 (2002)。

Kokame K, et al.: "Mutations and common polymorphisms in ADAMTS13 gene responsible for von Willebrand factor-cleaving protease activity"Proceedings of National Academy Science USA. 99. 11902-11907 (2002)

Kokame K 等人：“ADAMTS13 基因中负责冯维勒布兰德因子裂解蛋白酶活性的突变和常见多态性”美国国家科学院院刊。

Ashida A, et al.: "A successful treatment of a young infant who developed high-titer inhibitors against WWF-cleaving protease (ADAMTS13)"American Journal of Hematology. 71. 318-322 (2002)

Ashida A 等人：“成功治疗了一名小婴儿，该婴儿开发出了针对 WWF 裂解蛋白酶 (ADAMTS13) 的高滴度抑制剂”《美国血液学杂志》。

Hayashi T, et al.: "Low-dosage intravenous immunoglobulin in the management of a patient with acquired von willebrand syndrome associated with monoclonal gammopathy of undetermined significance"Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis. 32. 33-39 (200

Hayashi T 等人：“低剂量静脉注射免疫球蛋白治疗患有与单克隆丙种球蛋白病相关的获得性冯威勒布兰德综合征的患者，意义未定”《止血和血栓形成的病理生理学》。

Park Y-D, et al.: "Impaired activity of plasma von Willebrand factor-cleaving protease may predict the occurrence of hepatic veno-occlusive disease after stem cell"Bone Marrow Transplantation. 29. 789-794 (2002)

Park Y-D 等人：“血浆血管性血友病因子裂解酶活性受损可能预测干细胞”骨髓移植后肝静脉闭塞性疾病的发生。