膵島α細胞の形態形成とグルカゴン遺伝子の発現調節に関わる転写因子の単離と解析

胰岛α细胞形态发生及胰高血糖素基因表达调控相关转录因子的分离与分析

• 批准号: 13770647
• 负责人: 小杉 知里
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13770647/
• 关键词: グルカゴン; 転写因子

平成13年度の研究において酵母Two-Hybrid法により転写因子BETA2と結合する蛋白として単離した新規遺伝子Alpha1について以下の研究を行なった。1.Alpha1によるグルカゴン遺伝子転写調節能の検討Alpha1の全長cDNA配列を哺乳動物細胞で組み換え蛋白発現させるためのベクターであるpRC/CMVに組み込み、既にクローニング済みであるマウスグルカゴンプロモーター配列をルシフェラーゼ遺伝子の5'上流に結合させたレポータープラスミドと共に、マウス膵α細胞由来細胞株であるα-TC1.6細胞(グルカゴンの高発現が認められる細胞株)に導入し、48時間培養後にルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、まずグルカゴンプロモーター配列を含むレポータープラスミドを導入したものでは、グルカゴンプロモーター配列を含まないレポータープラスミドを導入したものと比べて、ルシフェラーゼ活性は数十倍高くなった。また、Alpha1をpRC/CMVベクターに組み込んで過剰発現させたα-TC1.6細胞ではルシフェラーゼ活性のさらなる上昇が認められた。従って、今回同定した新規遺伝子Alpha1はグルカゴン遺伝子の転写活性化に関与している可能性が高いと考えられた。2.培養細胞におけるAlpha1蛋白発現の検討Alpha1に対するペプチド抗体を作成し、α-TC1.6細胞および膵β細胞由来細胞株MIN6細胞より抽出した蛋白質を用いてWestern blot法により、培養細胞におけるAlpha1の蛋白発現について検討した。その結果、アミノ酸配列より予測されたサイズは30kDaであるが、これよりも大きなサイズのおよそ38〜40kDaのバンドが認められた。このサイズの違いについては、Alpha1蛋白の翻訳後修飾の可能性が示唆され、現在検討中である。

In 2013, the yeast Two-Hybrid method was used to study the following factors: BETA2, protein binding, and Alpha1. 1. Alpha1 gene expression regulatory function detection Alpha1 full-length cDNA alignment Mammalian cell assembly protein production, pRC/CMV assembly, both in the open source, 5 'upstream binding, open source, open source, 5' upstream binding The α-TC1.6 cells were cultured for 48 hours after introduction and the activity of α-TC1.6 cells was measured. As a result, the activity of the mobile phone is ten times higher than that of the mobile phone. Alpha1, pRC/CMV, pRC/CMV, pRC The probability of activation of the new gene Alpha1 is very high. 2. Alpha1 protein production in cultured cells was investigated by Western blot. Alpha 1 protein production in cultured cells was investigated by antibody preparation, α-TC1.6 cells and β-cell-derived cell line MIN6 cells. The results are as follows: 1. The acid sequence is predicted to be 30kDa, and the acid sequence is 38 ~ 40kDa. The possibility of post-translational modification of Alpha1 protein is discussed in this paper.