BARD1のSplicing variant,BARD1 Δringの機能解析

BARD1 剪接变体、BARD1 Δring 的功能分析

• 批准号: 13770681
• 负责人: 川本 久紀
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: St. Marianna University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13770681/
• 关键词: 家族性乳癌; BARD1; Splicing; variant; ユビキチンリガーゼ; BRCA1

(1)BARD1 Δ ringはエクソン2-6を欠失したBARD1のsplicing vari antで、RING fingerの大部分とAnkyrin repeatを欠失しているがBRCT domainが保持されていた。In vivoでの発現状況を解析するため、C-末端のポリペプチド(CVMSFELLPLDS)に対するラビットポリクローナル抗体を作成したが、作成された抗体は免疫沈降には使用可能であったが、immunoblottingには使用できず、EndogenousなBARD1 Δ ringを検出し得なかった。現在、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動解析システムおよびマススペクトロメーター(LCQイオントラップLC/MS^nシステム)を用いてEndogenousなBARD1 Δ ringの同定を試みている。一方、BARD1 Δ ringの機能解析はpcDNA3ベクターを用いて293T細胞内の一過性発現の系にておこなった。その結果、BARD1 Δ ringはBRCA1のRINGドメインと結合せず、ユビキチンリガーゼ活性を持たないが、BRCA1およびBARD1 (full length)とともにTriple transfectionするとBRCA1-BARD1に結合しこれを安定化することによってユビキチンリガーゼ活性を高める可能性が示された。また、GFP-tagをつけたBARD1 Δ ringを作製して細胞内における局在を解析したところ、Full lengthのBARD1と同様に核内Dot形成をすることが判明した。このことからBARD1の核内Dot形成にはRING fingerとAnkyrin repeatが不要であることが示唆された。(2)BRCA1およびBRAD1に相同性を有するタンパク質のユビキチンリガーゼ活性ついて解析した。BRCA1のRINGフィンガードメインに相同性をもつ遺伝子としてHR18BおよびEfp (estrogen-responsive finger protein)、BARD1のRINGフィンガードメインに相同性をもつ遺伝子としてHR18Aを単離し、大腸菌よりrecombinantタンパク質を精製した。HR18AおよびEfpは単独にてユビキチンリガーゼ活性を認めた。特にEfpは非常に強い活性を持ち、この活性は、ユビキチン結合酵素(E2)としてUbcH5cを用いた時のみに認め、UbcH2を用いた際には活性を認めなかった。

(1)BARD1 Δ ring is missing, BARD1 splitting vari ant is missing, most of Ring finger is missing, Ankyrin repeat is missing, BRCT domain remains missing. In vivo detection status analysis, C-terminal fragment (CVMSFELLPLDS), corresponding to the detection of the detection of Now, the optical identification of the secondary dimension of the optical identification of the electrical migration analysis of the system, the selection of the system (LC/MS^n), the use of the Endogenous BARD1 Δ ring identity test. Analysis of the function of BARD1 Δ ring and pcDNA3 in 293T cells The results show that BRCA1 Δ ring has a high probability of binding to BRCA1 and BARD1 (full length) and Triple transfection to BRCA1-BARD1. GFP-tag is used to control the formation of intracellular dots. BARD1's nuclear Dot formation is RING finger and Ankyrin repeat. (2) BRCA1 and BRAD1 identity analysis BRCA1's RING gene identity is the same as that of HR18B and Efp (estrogen-responsive finger protein), BARD1's RING gene identity is the same as that of HR18A, and Escherichia coli recombination is refined. HR18A and Efp are independent of each other. Efp is very active, and its activity is very strong. It binds to enzyme (E2) and UbcH5c.

项目成果

宮本圭子: "BRCA1とBARD1に相同性を持つRINGフィンガータンパク質、HR18A, HR18BおよびEfpのユビキチンリガーゼ活性の解析"聖マリアンナ医科大学雑誌. 30・4. 371-378 (2002)

Keiko Miyamoto：“与 BRCA1 和 BARD1 同源的 HR18A、HR18B 和 Efp、RING 指蛋白的泛素连接酶活性分析”，圣玛丽安娜大学医学院杂志 30・4（2002 年）。