BARD1のSplicing variant,BARD1 Δringの機能解析

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(1)BARD1 Δ ringはエクソン2-6を欠失したBARD1のsplicing vari antで、RING fingerの大部分とAnkyrin repeatを欠失しているがBRCT domainが保持されていた。In vivoでの発現状況を解析するため、C-末端のポリペプチド(CVMSFELLPLDS)に対するラビットポリクローナル抗体を作成したが、作成された抗体は免疫沈降には使用可能であったが、immunoblottingには使用できず、EndogenousなBARD1 Δ ringを検出し得なかった。現在、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動解析システムおよびマススペクトロメーター(LCQイオントラップLC/MS^nシステム)を用いてEndogenousなBARD1 Δ ringの同定を試みている。一方、BARD1 Δ ringの機能解析はpcDNA3ベクターを用いて293T細胞内の一過性発現の系にておこなった。その結果、BARD1 Δ ringはBRCA1のRINGドメインと結合せず、ユビキチンリガーゼ活性を持たないが、BRCA1およびBARD1 (full length)とともにTriple transfectionするとBRCA1-BARD1に結合しこれを安定化することによってユビキチンリガーゼ活性を高める可能性が示された。また、GFP-tagをつけたBARD1 Δ ringを作製して細胞内における局在を解析したところ、Full lengthのBARD1と同様に核内Dot形成をすることが判明した。このことからBARD1の核内Dot形成にはRING fingerとAnkyrin repeatが不要であることが示唆された。(2)BRCA1およびBRAD1に相同性を有するタンパク質のユビキチンリガーゼ活性ついて解析した。BRCA1のRINGフィンガードメインに相同性をもつ遺伝子としてHR18BおよびEfp (estrogen-responsive finger protein)、BARD1のRINGフィンガードメインに相同性をもつ遺伝子としてHR18Aを単離し、大腸菌よりrecombinantタンパク質を精製した。HR18AおよびEfpは単独にてユビキチンリガーゼ活性を認めた。特にEfpは非常に強い活性を持ち、この活性は、ユビキチン結合酵素(E2)としてUbcH5cを用いた時のみに認め、UbcH2を用いた際には活性を認めなかった。