熱ショック蛋白hsp90の神経系細胞に対する保護機構の解明

本年度は、electroporation法により、ヒトHSP90遺伝子のラット脳内への導入を試みた。<方法>Sprague-Dawleyラットをハロセン吸入麻酔による全身麻酔下に頭蓋固定装置(Narishige, Tokyo, Japan)に固定し、定位的に海馬CA1および線条体にプローブを挿入した。導入ベクターDNAおよびHSP90DNA各20μgを4μl/minの速度で注入し、electoroporator CUY(TR Tech, Tokyo, Japan)を使用してelectroporationを行った。Electroporationは2μsecの通電と98μsecの非通電を10回、計1秒間行い、電圧は50V〜150Vとして、通電時にヒゲが動くことを正しく通電されていることの目安とした。電極間隔は1mmまたは2mmに設定した。導入から一時間〜一週間後に4%パラホルムアルデヒドで固定し、冠状断切片を作成してHE染色により組織学的検討を行った。また、ベクターにβ-galactosidaseがコードされていることを利用し、β-galactosidase蛋白を染色することにより遺伝子導入の確認を行った。<結果>組織学的検討の結果、穿刺や通電に伴う脳組織の損傷が大きいこと、ベクターは極めてわずかの細胞にのみ導入されていたことが確認された。<結論>今回の遺伝子導入法では効率の良い遺伝子導入ができず、さらなる検討を要すると考えられた。今後は導入の際の各種パラメーターの調整を行って導入効率の改善を目指す。また、最近では胎生期ラットへの遺伝子導入の成功例も報告されており、より幼弱なラットを用いたelectroporation法も検討する予定である。

本年度は、electroporation法により、ヒトHSP90遺伝子のラット脳内への導入を試みた。<方法>Sprague-Dawleyラットをハロセン吸入麻酔による全身麻酔下に頭蓋固定装置(Narishige, Tokyo, Japan)に固定し、定位的に海馬CA1および線条体にプローブを挿入した。導入ベクターDNAおよびHSP90DNA各20μgを4μl/minの速度で注入し、electoroporator CUY(TR Tech, Tokyo, Japan)を使用してelectroporationを行った。Electroporationは2μsecの通電と98μsecの非通電を10回、計1秒間行い、電圧は50V〜150Vとして、通電時にヒゲが動くことを正しく通電されていることの目安とした。電極間隔は1mmまたは2mmに設定した。導入から一時間〜一週間後に4%パラホルムアルデヒドで固定し、冠状断切片を作成してHE染色により組織学的検討を行った。また、ベクターにβ-galactosidaseがコードされていることを利用し、β-galactosidase蛋白を染色することにより遺伝子導入の確認を行った。<結果>組織学的検討の結果、穿刺や通電に伴う脳組織の損傷が大きいこと、ベクターは極めてわずかの細胞にのみ導入されていたことが確認された。<結論>今回の遺伝子導入法では効率の良い遺伝子導入ができず、さらなる検討を要すると考えられた。今後は導入の際の各種パラメーターの調整を行って導入効率の改善を目指す。また、最近では胎生期ラットへの遺伝子導入の成功例も報告されており、より幼弱なラットを用いたelectroporation法も検討する予定である。