CD28を介する細胞内情報伝達機構におけるLATのリン酸化の関与の検討

LAT磷酸化参与CD28介导的细胞内信号转导机制的研究

• 批准号: 13770881
• 负责人: 土田 昌弘
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Yamaguchi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13770881/
• 关键词: CD28; CD3; Pyk2; LAT; チロシンリン酸化; T細胞副刺激伝達経路; Jurkat T cell; 抗CD28

Jurkat T細胞を抗CD28抗体(Leu-28,clone L293)(Becton Dickinson; San Jose, CA),CD3抗体(Ancell; Bayport, MN)にて刺激後,蛋白を可溶化しSDS-PAGEにより分離、PVDF膜にelectrotransfer後、抗ホスフォチロシン抗体(PY20)(Transduction Laboratorics; Lcxington, KY)にてチロシンリン酸化蛋白を標識、LumiGLO kit (Kirkegaard ＆ Perry Laboratories; Gaithersburg, MD)にて可視化させた。CD28,CD3抗体刺激により速やかに数種類の蛋白がチロシンリン酸化されることが確認できた。次いでJurkat T細胞をCD28抗体,CD3抗体にて同様に刺激後,抗Pyk2抗体,抗LAT抗体によりPyk2,LATを免疫沈降しPyk2,LATのチロシンリン酸化を検討したところ,CD28抗体刺激により速やかにPyk2,LATのチロシンリン酸化を認めた。Syk/Zap70 inihibitorであるpiceatannol、PI3-kinase inhibiotrであるwortmanninにより前処理したJurkat T細胞を抗CD3抗体、または抗CD28抗体により刺激後、同様にPyk2,LATのチロシンリン酸化を検討したところ,Zap70 inhibitorによりCD28抗体刺激後のPyk2のチロシンリン酸化は減少したが,PI3-kinase inhibitorによっては減少しなかったPMA処理によりJurkat T cellよりPKCが枯渇されることが知られているが、同処理によりJurkat T細胞を処理後、同様にPyk2,LATのチロシンリン酸化を検討したところ,Pyk2,LATのチロシンリン酸化には影響を与えなかった。以上の結果より我々が以前報告したようにPyk2のチロシンリン酸化がCD28を介するT細胞副刺激伝達経路に関与していることが再確認できた。また新たにLATがCD28を介するT細胞副刺激伝達経路に関与していることが示唆された。

Jurkat T cells generate anti-CD28 antibodies (Leu-28,clone L293)(Becton Dickinson; San Jose, CA), CD3 Antibody (Ancell; Bayport, MN) After stimulation, protein solubilization, SDS-PAGE separation, PVDF membrane after electrotransfer, anti-protein antibody (PY20)(Transduction Laboratories; Lcxington, KY), LumiGLO kit (Kirkegaard & Perry Laboratories; Gaithersburg, MD), CD28, CD3 antibody stimulation of several types of protein, protein, protein Second, Jurkat T cells were stimulated with CD28 antibodies and CD3 antibodies in the same way. Anti-Pyk2 antibodies and anti-LAT antibodies inhibited Pyk2,LAT immunoprecipitated Pyk2, and LAT's intracellular acidification was discussed. However, stimulation with CD28 antibodies inhibited Pyk2, and LAT's intracellular acidification was recognized. Syk/Zap70 inihibitor: Piceatannol, PI3-kinase inhibitor: Wortmannin, anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody, anti-Pyk2,LAT antibody, anti-CD28 antibody. PI3-kinase inhibitor can reduce the activity of Jurkat T cell after PMA treatment, and can also reduce the activity of Pyk2, LAT. These results were reconfirmed by our previous reports on the role of Pyk2 in the regulation of CD28 in T cell accessory pathways. The new CD28-mediated T cell accessory pathway is associated with the development of a new pathway.