低温誘導性蛋白RBM3の精子形成における働きに関する研究

昨年度、作成したRBM3に対するアンチセンスオリゴ、およびセンスオリゴのTAMA26(マウスセルトリ細胞株)におけるRBM3蛋白の抑制効果をポリクローナル抗体を用いて確認を行なったが、不完全であったため新たにアンチセンスオリゴの作成を行なった。今回はGENE TOOLS社のSpecial Delivery Morpholino oligoにて作成を行なった。この方法ではspecial delivery systemにより飛躍的に細胞内へのオリゴヌクレオチドの取り込みが改善することが期待された。まずTAMA26に対して低温ショック(37℃で細胞の継代を続けた後、これらセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入、約3時間インキュベートの後、32℃に移した)を与え、RBM3の発現の差を確認した。確認の方法としてはこれら細胞株から蛋白を抽出後、RBM3に対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティング法を用いた。その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドを加えたTAMA26においてセンスオリゴヌクレオチドをクワイ得たものに比較しRBM3の発現の抑制効果が確認できた。さらにAmbion社のRNAqueous(total RNA isolation kit)をもちいて残りの細胞からtotalRNAを抽出。これから作成したcDNAをもとにDNAチップをもちいてマウスでの既知遺伝子の発現への影響が検討可能となる。今回、われわれはアンチセンスオリゴの改変により低温ショック蛋白RBM3が、マウスセルトリ細胞株において抑制可能であることを証明した。今後この方法は、RBM3が細胞内でいかなる機能を持っているかを解析する上で有効な手段となり得ると考えられた。

昨年度、作成したRBM3に対するアンチセンスオリゴ、およびセンスオリゴのTAMA26(マウスセルトリ細胞株)におけるRBM3蛋白の抑制効果をポリクローナル抗体を用いて確認を行なったが、不完全であったため新たにアンチセンスオリゴの作成を行なった。今回はGENE TOOLS社のSpecial Delivery Morpholino oligoにて作成を行なった。この方法ではspecial delivery systemにより飛躍的に細胞内へのオリゴヌクレオチドの取り込みが改善することが期待された。まずTAMA26に対して低温ショック(37℃で細胞の継代を続けた後、これらセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入、約3時間インキュベートの後、32℃に移した)を与え、RBM3の発現の差を確認した。確認の方法としてはこれら細胞株から蛋白を抽出後、RBM3に対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティング法を用いた。その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドを加えたTAMA26においてセンスオリゴヌクレオチドをクワイ得たものに比較しRBM3の発現の抑制効果が確認できた。さらにAmbion社のRNAqueous(total RNA isolation kit)をもちいて残りの細胞からtotalRNAを抽出。これから作成したcDNAをもとにDNAチップをもちいてマウスでの既知遺伝子の発現への影響が検討可能となる。今回、われわれはアンチセンスオリゴの改変により低温ショック蛋白RBM3が、マウスセルトリ細胞株において抑制可能であることを証明した。今後この方法は、RBM3が細胞内でいかなる機能を持っているかを解析する上で有効な手段となり得ると考えられた。