転写因子Sp1によるNMDA受容体の発現調節とエタノール受容体同定に関する研究

エタノールが様々な遺伝子のmRNA発現に影響することから,我々はそのうち1つである,NNMDA受容体2Bサブユニット遺伝子(以下NR2B)を用い,エタノールによる遺伝子発現の制御機構を調べた.まず,ヒトNR2Bの転写調節領域(転写開始点より上流約1.2kb)をbeta-Galactosidase reporter vectorに組み込んだコンストラクトを作成した.これをもとに,転写開始点より上流約1kbから約100bまでの様々なサイズのコンストラクトを計7つ作成した。最長の転写領域を含むplasmidと,internal standardとしてRenilla luciferase plasmidをPC12細胞にtransfectした。その後,NGFを投与し神経細胞に分化させた。この細胞に,エタノール50,100,150,200mMを投与し,非投与群とbeta-Galactosidase Assayの結果を比較した。その結果,200mMで2日間投与した群が,非投与群に比べ転写活性が約2倍上昇することが分かった。次に,この条件下で,7つのコンストラクトをそれぞれ培養細胞にtransfectし,同様の解析を行った。その結果,NR2Bの転写領域の上流域を含む群では,エタノール投与によりbeta-Galactosidase活性が有意に上昇することが分かった。また,3つのSp1結合部位の1つの配列に変異を加えた場合,エタノールによる転写活性に有意な変化を与えなかった。以上の結果から,NR2B遺伝子の転写調節領域の上流に,エタノールによる遺伝子発現に重要な領域が存在すると予想された。また,3つのSp1のうちの1つは,エタノールによる転写調節には関与しないことが明らかとなった。今後,この実験系を継続し,エタノールがNR2B遺伝子の転写調節に影響を及ぼす領域を明らかにしていく予定である。

エタノールが様々な遺伝子のmRNA発現に影響することから,我々はそのうち1つである,NNMDA受容体2Bサブユニット遺伝子(以下NR2B)を用い,エタノールによる遺伝子発現の制御機構を調べた.まず,ヒトNR2Bの転写調節領域(転写開始点より上流約1.2kb)をbeta-Galactosidase reporter vectorに組み込んだコンストラクトを作成した.これをもとに,転写開始点より上流約1kbから約100bまでの様々なサイズのコンストラクトを計7つ作成した。最長の転写領域を含むplasmidと,internal standardとしてRenilla luciferase plasmidをPC12細胞にtransfectした。その後,NGFを投与し神経細胞に分化させた。この細胞に,エタノール50,100,150,200mMを投与し,非投与群とbeta-Galactosidase Assayの結果を比較した。その結果,200mMで2日間投与した群が,非投与群に比べ転写活性が約2倍上昇することが分かった。次に,この条件下で,7つのコンストラクトをそれぞれ培養細胞にtransfectし,同様の解析を行った。その結果,NR2Bの転写領域の上流域を含む群では,エタノール投与によりbeta-Galactosidase活性が有意に上昇することが分かった。また,3つのSp1結合部位の1つの配列に変異を加えた場合,エタノールによる転写活性に有意な変化を与えなかった。以上の結果から,NR2B遺伝子の転写調節領域の上流に,エタノールによる遺伝子発現に重要な領域が存在すると予想された。また,3つのSp1のうちの1つは,エタノールによる転写調節には関与しないことが明らかとなった。今後,この実験系を継続し,エタノールがNR2B遺伝子の転写調節に影響を及ぼす領域を明らかにしていく予定である。