クッシング病下垂体腺腫におけるCRF受容体遺伝子発現調節異常のメカニズムの解明

阐明库欣病垂体腺瘤中CRF受体基因表达失调的机制

• 批准号: 14770587
• 负责人: 酒井 謙
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Juntendo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14770587/
• 关键词: クッシング病; CRF受容体遺伝子; AtT20細胞; CRF応答性cis-element; CRF応答性転写因子; 下垂体腺腫; 遺伝子発現調節異常; 転写開始点

下垂体腺腫細胞における、CRFによるCRFレセプター遺伝子発現活性化a)CRF応答性CRF遺伝子発現に重要なcis-elementの同定昨年度実績報告したCRFレセプタープロモーター(上流6kb)を有するルシフェラーゼレポーター遺伝子コンストラクトを、AtT20細胞にtransient transfectionした系において、CRFは濃度依存性に転写活性を上昇させた。次にCRF応答性のcis-elementを絞り込む目的で、5'からdeletionを加えた数個のコンストラクトを作成し、前述と同様の系において検討した。その結果、-420〜-360base領域を欠くものにおいて、CRF添加による転写活性上昇効果が85%キャンセルされた。同部位の塩基配列には、既知の転写因子のコンセンサス配列は存在していなかった。b)CRF応答性転写因子の同定-420〜-360base領域をP^<32>にてラベルしたoligonucleotide及び、CRF添加前後でのAtT20細胞核内抽出物を用いてgel-shift assayを行った。その結果CRF添加前核内抽出物との反応ではほとんど確認できなかった単一のバンドをCRF添加後核内抽出物との反応で確認した。次にCREB、ATF等々の抗体を用いたsuper-shiftの検討を行った。しかし、検討した既知の転写因子に対する抗体によるsuper-shiftは、確認できなかった。今後は、-420〜-360base領域のOligo nucleotideを用いて同領域に結合しているタンパクの単離を目指す方針である。

CRF gene expression activation in pituitary gland cells a)CRF responsive CRF gene expression and critical cis-element activity increased in a concentration-dependent manner in AtT20 cells. Next, CRF response cis-element is selected for the purpose, 5'deletion is selected for the purpose, and the same system is selected for the purpose. Results: -420 ~-360 base fields are not available, CRF is added, and the activity increases to 85%. The same part of the base array, known as the write factor of the set of base array does not exist. b)CRF response factors were identified in the range of-420 ~-360base. <32>The results showed that the gel-shift assay was used in nuclear extracts of AtT20 cells before and after CRF addition. The results of CRF addition before the nuclear extractives and the reverse confirmation of CRF addition after the nuclear extractives and the reverse confirmation Sub-CREB, ATF, etc. are used in super-shift discussions. The super-shift of antibodies against known transcription factors has been confirmed. In the future, the use of Oligo nucleotides in the-420 ~-360 base domain will be combined with the use of single target policies in the same domain.