クッシング病下垂体腺腫におけるCRF受容体遺伝子発現調節異常のメカニズムの解明

下垂体腺腫細胞における、CRFによるCRFレセプター遺伝子発現活性化a)CRF応答性CRF遺伝子発現に重要なcis-elementの同定昨年度実績報告したCRFレセプタープロモーター(上流6kb)を有するルシフェラーゼレポーター遺伝子コンストラクトを、AtT20細胞にtransient transfectionした系において、CRFは濃度依存性に転写活性を上昇させた。次にCRF応答性のcis-elementを絞り込む目的で、5'からdeletionを加えた数個のコンストラクトを作成し、前述と同様の系において検討した。その結果、-420〜-360base領域を欠くものにおいて、CRF添加による転写活性上昇効果が85%キャンセルされた。同部位の塩基配列には、既知の転写因子のコンセンサス配列は存在していなかった。b)CRF応答性転写因子の同定-420〜-360base領域をP^<32>にてラベルしたoligonucleotide及び、CRF添加前後でのAtT20細胞核内抽出物を用いてgel-shift assayを行った。その結果CRF添加前核内抽出物との反応ではほとんど確認できなかった単一のバンドをCRF添加後核内抽出物との反応で確認した。次にCREB、ATF等々の抗体を用いたsuper-shiftの検討を行った。しかし、検討した既知の転写因子に対する抗体によるsuper-shiftは、確認できなかった。今後は、-420〜-360base領域のOligo nucleotideを用いて同領域に結合しているタンパクの単離を目指す方針である。

下垂体腺腫細胞における、CRFによるCRFレセプター遺伝子発現活性化a)CRF応答性CRF遺伝子発現に重要なcis-elementの同定昨年度実績報告したCRFレセプタープロモーター(上流6kb)を有するルシフェラーゼレポーター遺伝子コンストラクトを、AtT20細胞にtransient transfectionした系において、CRFは濃度依存性に転写活性を上昇させた。次にCRF応答性のcis-elementを絞り込む目的で、5'からdeletionを加えた数個のコンストラクトを作成し、前述と同様の系において検討した。その結果、-420〜-360base領域を欠くものにおいて、CRF添加による転写活性上昇効果が85%キャンセルされた。同部位の塩基配列には、既知の転写因子のコンセンサス配列は存在していなかった。b)CRF応答性転写因子の同定-420〜-360base領域をP^<32>にてラベルしたoligonucleotide及び、CRF添加前後でのAtT20細胞核内抽出物を用いてgel-shift assayを行った。その結果CRF添加前核内抽出物との反応ではほとんど確認できなかった単一のバンドをCRF添加後核内抽出物との反応で確認した。次にCREB、ATF等々の抗体を用いたsuper-shiftの検討を行った。しかし、検討した既知の転写因子に対する抗体によるsuper-shiftは、確認できなかった。今後は、-420〜-360base領域のOligo nucleotideを用いて同領域に結合しているタンパクの単離を目指す方針である。