偏性嫌気性菌における薬剤排出機構の解明

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我々は,現在までに,宿主大腸菌の複数の薬剤に対する抵抗性を高めるBacteroides thetaiot aomicron ゲノムDNA断片のクローン化に成功し,その遺伝子.(bexAと名付けた)を同定した.そして,種々の検討から,bexA遺伝子は明らかに薬剤排出ポンプに関わる遺伝子であり,さらに薬剤排出ポンプの中では新しいMATEファミリーに属することを証明した.しかし,Bacteroides fragilis groupの中で,特に嫌気性菌感染症に関与するとされている,B.fragilis からは,B.thetaiotaomicronと同様のDNA断片のクローン化には成功していなかった.そこで,現在B.fragilisのgenome解析を遂行しているSanger InstituteのwebサイトからB.fragilis塩基配列に対して,bexAの塩基配列をテンプレートとしたBLASTサーチを行なうと,高確立で相同性を示すDNA領域がヒットした.そこで,その遺伝子領域の5'と3'にプライマーを設計し,B.fragilis ATCC25285染色体DNAをテンプレートとしてPCRにて増幅した(1,090bp).その増幅されたDNA断片をスーサイドベクターpGERMに組み込み,大腸菌DH5αに導入した.得られたリコンビナントを制限酵素地図を作成して確認し,再度大腸菌S17-1に導入した.そのS17-1とB.fragilis ATCC25285株をMaitingし,B.fragilisの同遺伝子領域ノックアウト株作成を試みた.ゲンタマイシン,エリスロマイシンが添加されたGAMプレート上に出現した7コロニーを得た.その7コロニーとコントロールとしての親株の薬剤感受性をノルフロキサシンについて調べると,親株に対してその7コロニーは全て感受性が増していた.これにより,B.fragilisの薬剤排出ポンプをコードする遺伝子領城,すなわちbexAと相同性を有する領域がノックアウトされた事が考えられる.今後は,このリコンビナントプラスミドとそのDNA断片やノックアウト株について益々検討を加えていく予定である.