一酸化窒素還元酵素の活性中心構造と触媒反応機構の解明

一氧化氮还原酶活性中心结构及催化反应机制的阐明

• 批准号: 14780487
• 负责人: 片岡 邦重
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780487/
• 关键词: 一酸化窒素還元酵素; マルチヘムタンパク質; 呼吸系膜エネルギー装置; 異種発現系

Halomonas halodenitrificans(旧称Palacoccus halodenitrificans)由来の一酸化窒素還元酵素(NOR)の活性中心を含むNorBサブユニットをコードするnorB遺伝子をpTrc99Aベクターのtrcプロモーター制御下に連結した発現プラスミドを作製し、ヘム合成能が増強された大腸菌Escharichia coli JCB7120株をホストに用いてNorBサブユニットの異種発現を行った。嫌気培養によりNorBを発現させた菌体から超音波破砕と超遠心分離により膜画分を調整し、Nonyl-β-D-glucosideを用いて膜タンパク質を可溶化後、陰イオン交換クロマトグラフィーにより組換え型NorBを部分精製し、その分光学的性質を野生型NORと比較した。NorB部分精製標品の吸収スペクトルでは還元型で558,527,422nmにそれぞれα,β,γ吸収帯を示し、MCDスペクトルでは酸化体のソーレ領域(420nm)と還元型のQバンド領域(560nm)に低スピンヘム鉄の吸収と、還元型のソーレ領域(430nm)に高スピンヘム鉄に特徴的な吸収が観察された。これらの吸収は野生型NORの低スピンヘムbおよび高スピンヘムb_3の吸収とよく類似していた。従って大腸菌で異種発現した組換え型NorBは野生型NORと同様に2種のB型ヘムを含むことが明らかになった。また、組換え型NorBのESRスペクトルではg=3.14,2.27に低スピンヘム鉄(III)に特徴的な斜方対称のシグナルと、g=5.99に高スピンヘム鉄(III)のシグナルが確認できたが、非ヘム鉄の存在を示唆するg=4.26のシグナル強度が野生型NORの対応するシグナルより強く、ヘムb_3-非ヘム鉄からなる複核中心の酸素架橋構造に違いがあると考えられる。

The origin of Halomonas halodenitrificans (formerly known as Palacoccus halodenitrificans) is that the active center of asphyxiated asphyxinase (NOR) contains NorB asphyxiating enzyme (NOR). The active center of asphyxianase (NOR) contains NorB, asphyxiant, norB, pTrc99A, trc, trc, and so on. the synthesis of asphyxiated asphyxiant isoenzyme (NOR) has the ability to improve the performance of bacteria strain Escharichia coli JCB7120. The bacteria were detected by ultrasound, the heart was separated by ultrasound, the membrane was separated by Nonyl- β-D-glucoside, the membrane was dissolved by Nonyl- β-D-glucoside, and the results showed that the bacteria were isolated by ultrasound, the heart was separated by ultrasound, the membrane was separated, the membrane was dissolved, and the results showed that some of the samples were purified, and the optical properties of wild-type NOR were analyzed. Some of the NorB products are sensitive to 558527422nm, β, γ, 420nm, 420nm, 560nm, 430nm, 430nm, etc. The wild type NOR has a low temperature, a low temperature, a high temperature, a high temperature, a low temperature, a low temperature, a high temperature, a high temperature, a low temperature, a wild type, a low temperature, a high temperature, a high temperature, a low temperature, a high temperature, a low temperature, a high temperature, a high temperature, a low temperature, a high temperature, a high temperature, a low temperature, a high temperature There are several types of bacteria, NorB, wild type, NOR, and type B, which are the same as those of the same type. The trapezoid of the III is called the trapezoid, the III is the highest, the strength is 4.26%, the strength of the wild type is 4.26%, the strength of the wild type is not strong. Please do some research on the construction of the acid frame in the copy nuclear center.