銅型亜硝酸還元酵素の構造と触媒反応機構および電子伝達機構に関する研究

铜型亚硝酸还原酶的结构、催化反应机制及电子传递机制研究

• 批准号: 11780428
• 负责人: 片岡 邦重
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11780428/
• 关键词: 亜硝酸還元酵素; メタノール資化性菌; 電子伝達反応; チトクローム; nitrite reductase; copper protein; type 1 Cu; type 2 Cu; Alcaligenes xylosoxidans

Cl化合物を唯一の炭素原として生育することができる微生物の一種、メタノール資化性脱窒菌Hyphomycrobium sp.A3151株の生産する銅型亜硝酸還元酵素(HypNIR)はサブユニット分子量が大きく、銅含量、分光学的性質が他の銅型NIRと異なるなど特異な性質を有しており、その構造および機能に興味がもたれていた。そこで、HypNIR遺伝子のクローン化と遺伝子配列の決定を行なった。本菌から抽出したゲノムDNAを鋳型に、HypNIRのN末端および内部ペプチドのアミノ酸配列に基づき作成した合成DNAを用いてPCRを行うと、約600bpの遺伝子断片が特異的に増幅された。この断片をプローブにゲノムDNAライブラリーをスクリーニングした結果、約6KbpのHindIII断片を含む陽性クローンを得た。塩基配列の解析からHypNIR遺伝子のORFは1443bpで480アミノ酸残基をコードし、38残基からなるシグナルペプチドを除いた成熟タンパク質の分子量は47.9KDaであることが明らかになった。塩基配列から予想されるHypNIRの一次構造を他の銅含有NIRと比較したところ、C末端側の280残基(分子量31 KDa)で35%程度の相同性がみられ、2つの銅の配位残基もすべて保存されていた。これに対しN末端側は植物のブルー銅含有電子伝達タンパク質であるplastocyaninと33%の相同性を示し、その銅配位残基が保存されていた。これらの一次構造解析の結果は、HypNIRがサブユニット当たりType1銅を2原子含むという特異な分光学的性質とよく一致し、本酵素が銅含有NIRのN末端側に低分子量ブルー銅タンパク質が融合した新規な構造のNIRであることを示している。また、Hyphomycrobium sp.A3151株はpAzのような電子供与体となる低分子量ブルー銅タンパク質を発現しておらず、その電子供与タンパク質が不明であった。そこで電子供与体を検索したところ、同株の産するチトクロームc550が電子供与能を持つことが明らかになった。

Cl compounds を only の carbon original と し て fertility す る こ と が で き る microbiology の a, メ タ ノ ー ル Hyphomycrobium elasticity to take off the smothering bacteria Sp. の A3151 strain producing す る type copper 亜 nitrate also yuan enzyme (HypNIR) は サ ブ ユ ニ ッ ト が large molecular weight き く, copper content, the nature of the optical が he の type copper NIR と different な る な ど specific な nature を have し て お り, そ の tectonic お よ び function に tumblers が も た れ て い た. Youdaoplaceholder0 伝 で で, HypNIR legator 伝 ロ ロ 伝, and the matching of the と legator 伝 to determine を row なった. This bacterium か ら spare し た ゲ ノ ム DNA を where に, HypNIR の N terminal お よ び internal ペ プ チ ド の ア ミ ノ acid with column に base づ き made し た を DNA synthesis using い て PCR line を う と, about 600 bp の but 伝 fragment が specific に rights of さ れ た. こ の fragment を プ ロ ー ブ に ゲ ノ ム DNA ラ イ ブ ラ リ ー を ス ク リ ー ニ ン グ し た results, about six KBP の HindIII を fragment containing む positive ク ロ ー ン を た. Traces of salt base with column の parsing か ら HypNIR 伝 son の ORF は 1443 bp で 480 ア ミ ノ acid residues を コ ー ド し, 38 residues か ら な る シ グ ナ ル ペ プ チ ド を except い た mature タ ン パ ク qualitative の は molecular weight 47.9 KDa で あ る こ と が Ming ら か に な っ た. Salt base with column か ら to think さ れ る HypNIR の a structure containing NIR と copper を he の is し た と こ ろ, C terminal side の 280 residues (molecular weight 31 KDa) で 35% degree の identity が み ら れ, 2 つ の copper の ligand residues も す べ て save さ れ て い た. こ れ に し seaborne N terminal side は plant の ブ ル ー copper containing electronic 伝 da タ ン パ ク qualitative で あ る plastocyanin と 33% の identity を し, そ の copper ligand residues が save さ れ て い た. こ れ ら の a tectonic analytical results の は, HypNIR が サ ブ ユ ニ ッ ト when た り Type1 を 2 copper atoms contain む と い う specific な points of optical properties と よ く consistent し, this enzyme が copper containing NIR の N terminal side に low molecular weight ブ ル ー copper タ ン パ ク qualitative が fusion し た new rules な tectonic の NIR で あ る こ と を shown し て い る. ま た, Hyphomycrobium sp. A3151 strains は pAz の よ う な electronic body and supply と な る low molecular weight ブ ル ー copper タ ン パ ク qualitative を 発 now し て お ら ず, そ の electronic タ and supply ン パ ク qualitative が unknown で あ っ た. そ こ で electronic body and supply を 検 cable し た と こ ろ, homologous strain の is produced す る チ ト ク ロ ー ム c550 が electronic and を will hold つ こ と が Ming ら か に な っ た.

项目成果

片岡 邦重: "Functional Analysis of Conserved Aspartate and Histidine Residues Located Around the Type 2 Copper Site of Copper Containing Nitrite Reductase"The Journal of Biochemistry. 127-3. 345-350 (2000)

Kunishige Kataoka：“含铜亚硝酸还原酶 2 型铜位点周围的保守天冬氨酸和组氨酸残基的功能分析”《生物化学杂志》127-3 (2000)。

Suzuki S. et al.: "Intremolecular Electron-Transfer Process of Native and Mutant Forms of Blue Copper-Containing Nitrite Reductase from Alcaligenes xylosoxidans"Inorganic Reaction Mechanisms. 2・1-2. 129-135 (2000)

Suzuki S.等：“来自木糖氧化产碱菌的含蓝铜的亚硝酸盐还原酶的分子内电子转移过程”2·1-2（2000）。