銅型亜硝酸還元酵素の構造と触媒反応機構および電子伝達機構に関する研究

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Cl化合物を唯一の炭素原として生育することができる微生物の一種、メタノール資化性脱窒菌Hyphomycrobium sp.A3151株の生産する銅型亜硝酸還元酵素(HypNIR)はサブユニット分子量が大きく、銅含量、分光学的性質が他の銅型NIRと異なるなど特異な性質を有しており、その構造および機能に興味がもたれていた。そこで、HypNIR遺伝子のクローン化と遺伝子配列の決定を行なった。本菌から抽出したゲノムDNAを鋳型に、HypNIRのN末端および内部ペプチドのアミノ酸配列に基づき作成した合成DNAを用いてPCRを行うと、約600bpの遺伝子断片が特異的に増幅された。この断片をプローブにゲノムDNAライブラリーをスクリーニングした結果、約6KbpのHindIII断片を含む陽性クローンを得た。塩基配列の解析からHypNIR遺伝子のORFは1443bpで480アミノ酸残基をコードし、38残基からなるシグナルペプチドを除いた成熟タンパク質の分子量は47.9KDaであることが明らかになった。塩基配列から予想されるHypNIRの一次構造を他の銅含有NIRと比較したところ、C末端側の280残基(分子量31 KDa)で35%程度の相同性がみられ、2つの銅の配位残基もすべて保存されていた。これに対しN末端側は植物のブルー銅含有電子伝達タンパク質であるplastocyaninと33%の相同性を示し、その銅配位残基が保存されていた。これらの一次構造解析の結果は、HypNIRがサブユニット当たりType1銅を2原子含むという特異な分光学的性質とよく一致し、本酵素が銅含有NIRのN末端側に低分子量ブルー銅タンパク質が融合した新規な構造のNIRであることを示している。また、Hyphomycrobium sp.A3151株はpAzのような電子供与体となる低分子量ブルー銅タンパク質を発現しておらず、その電子供与タンパク質が不明であった。そこで電子供与体を検索したところ、同株の産するチトクロームc550が電子供与能を持つことが明らかになった。