リボザイム導入トランスジェニックマウスによるサイトメガロウイルス感染抑制の試み

マウスサイトメガロウイルス(MCMV)前初期(IE)遺伝子を標的としたリボザイムの作成マウスCMV(MCMV)のIE遺伝子のうちIE1とIE3に共通なmRNAに対するハンマーヘッド型リボザイムを数種類設計し、in vitro cleavageにて切断活性を確認した。MCMV IE mRNAを標的としたリボザイムの培養細胞への導入と発現in vitro cleavageの結果より、切断活性の高いリボザイムをtRNAプロモーターとpuromycin耐性遺伝子もつplasmidベクターに挿入した。このリボザイム発現ベクターをNIH3T3細胞にトランスフェクションし、puromycin耐性クローンを作製し、リボザイム高発現クローンをRT-PCRで確認した。リボザイム発現細胞におけるMCMV IE遺伝子産物の発現抑制と感染抑制の確認リボザイム高発現細胞および対照NIH3T3にMCMVを感染させた。MCMV IE遺伝子産物の発現をIE1特異抗体(N2)、を用いたフローサイトメトリーで経時的な解析を施行したところ、リボザイム高発現細胞では対照NIH3T3と比較して10倍程度のIE発現抑制効果を確認した。また、培養上清および細胞ホモジネートとマウス胎児線維芽細胞を用いたプラークアッセイによってもウイルス増殖抑制効果が確認された。MCMV潜伏感染モデルにおけるウイルス増殖抑制の試みF9細胞(teratocarcinoma cell line)にリボザイム発現ベクターを導入しリボザイム発現クローンを作成した。GFP発現MCMV感染後72時間のリボザイム発現クローンと対照F9をレチノイン酸により分化誘導したところ2週間後のGFP発現に著明な差がみられた。増殖抑制効果は、プラークアッセイとN2を用いたフローサイトメトリーによっても確認された。

マウスサイトメガロウイルス(MCMV)前初期(IE)遺伝子を標的としたリボザイムの作成マウスCMV(MCMV)のIE遺伝子のうちIE1とIE3に共通なmRNAに対するハンマーヘッド型リボザイムを数種類設計し、in vitro cleavageにて切断活性を確認した。MCMV IE mRNAを標的としたリボザイムの培養細胞への導入と発現in vitro cleavageの結果より、切断活性の高いリボザイムをtRNAプロモーターとpuromycin耐性遺伝子もつplasmidベクターに挿入した。このリボザイム発現ベクターをNIH3T3細胞にトランスフェクションし、puromycin耐性クローンを作製し、リボザイム高発現クローンをRT-PCRで確認した。リボザイム発現細胞におけるMCMV IE遺伝子産物の発現抑制と感染抑制の確認リボザイム高発現細胞および対照NIH3T3にMCMVを感染させた。MCMV IE遺伝子産物の発現をIE1特異抗体(N2)、を用いたフローサイトメトリーで経時的な解析を施行したところ、リボザイム高発現細胞では対照NIH3T3と比較して10倍程度のIE発現抑制効果を確認した。また、培養上清および細胞ホモジネートとマウス胎児線維芽細胞を用いたプラークアッセイによってもウイルス増殖抑制効果が確認された。MCMV潜伏感染モデルにおけるウイルス増殖抑制の試みF9細胞(teratocarcinoma cell line)にリボザイム発現ベクターを導入しリボザイム発現クローンを作成した。GFP発現MCMV感染後72時間のリボザイム発現クローンと対照F9をレチノイン酸により分化誘導したところ2週間後のGFP発現に著明な差がみられた。増殖抑制効果は、プラークアッセイとN2を用いたフローサイトメトリーによっても確認された。