複製開始点の系統的破壊による開始点特異性の解明とその制御因子の検索

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真核生物の染色体は多数の複製開始点から構成されるマルチレプリコン構造をとっており、個々の開始点は秩序正しく段階的に複製を開始していく。これまでに、初期開始点はS期の開始、後期開始点はチェックポイントの活性化に伴う複製の抑制、という役割をそれぞれ担っていることが明らかにされている。しかしながら、どのような機構により開始点が活性化されるタイミングが決定されているのか等のマルチレプリコン制御の基本的な問題に対しては未だ不明な部分が多い。本研究では、これらの問題に答えるべく、出芽酵母の第VI染色体から、点変異導入により系統的に複製開始点を欠失していくことで、初期開始点のみ、あるいは後期開始点のみから構成される改変染色体を構築し、その複製様式を詳細に追跡することにした。1、第VI染色体には10個の自律複製開始点が報告されており、各開始点の単独破壊染色体および初期開始点のみあるいは後期開始点のみを系統的に破壊した多重破壊染色体を構築した。この課程において2個の新たな自律複製開始点を発見した。2、HUによる複製ストレスに対して、全初期開始点破壊株および全後期開始点破壊株のみが感受性を示したことより、少なくとも1つの初期開始点と後期開始点が細胞の生存に必要であることが示唆された。3、染色体の安定性は、1つの複製開始点を破壊しただけでは0.5-2.4倍と野生型と変わらなかったが、全後期開始点を破壊した場合は3.7-3.8倍に、全初期開始点を破壊した場合には約40-44倍に上昇した。この結果より、染色体の安定性には初期開始点の方が重要であることが示唆された。4、二次元ゲル電気泳動法を用いて、各開始点の複製状況を経時的に観察した。その結果、全初期開始点破壊株でも後期開始点の複製開始時期は変化せず、複製開始のタイミングは開始点毎に決まっている可能性が示唆された。