多機能アダプタータンパク質GGAの細胞内小胞輸送における役割

多功能衔接蛋白GGA在细胞内囊泡运输中的作用

• 批准号: 03J00249
• 负责人: 芝 陽子
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kyoto University (2004)University of Tsukuba (2003)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J00249/
• 关键词: GGA; ユビキチン; GAT

本年度は昨年明らかにしたGGA-GATドメインとユビキチンとの結合様式をより詳細に調べるために、高エネルギー加速器研究機構の若槻壮市先生、名古屋市立大学の加藤晃一先生らの研究室とともにC-GATドメインとユビキチンとの三次元構造を決定した。まず若槻研究室におけるX線結晶構造解析により、C-GATドメインのN末端側とユビキチンとの複合体の構造を決定した。しかし、C-GATのN末端側とユビキチンが結合するという構造は以前私が変異体解析により同定したC-GATのC末端側がユビキチンとの結合サイトになるという結果とは異なっていた。結晶ではC-GATのC末端側に関してはC-GAT同士のダイマー形成に関与しており、ユビキチンとは結合していないが、C-GATのダイマー形成は溶液中では起こっておらず、おそらく結晶化時のアーティファクトと思われる。そこでC-GATのN末端側およびC末端側にそれぞれ変異を入れた変異体、および両方に変異を入れた変異体を作成し、pull down解析およびBIACOREを用いた定量的な結合実験を行ったところ、いずれも一カ所の変異でも結合能あるいは最大結合量が落ちるが、両方に変異を入れた変異体でさらに結合能が下がることがわかった。この結果からC-GATドメインは二カ所でユビキチンと結合していることが示唆された。GATのC末端側とユビキチンとの複合体の構造が依然はっきりしなかったため、加藤晃一先生との共同研究によりNMRによる解析を行った。NMRでも溶液中でC-GATは二ヶ所でユビキチンと結合することが確認でき、またC-GATのN末端側に変異を入れた変異体とユビキチンとの結合様式を調べることにより、C-GATのC末端側とユビキチンとの結合様式を調べることができた。この結果以前私が同定したユビキチンとの結合に重要なC-GATのC末端側の残基が重要な働きをすることが、NMR解析においてもあきらかとなった。

This year, the research office of Mr. Wakatsuki of the GGA-GAT accelerator research institute and Mr. Koichi Kato of Nagoya City University decided on the three-dimensional structure of the GGA-GAT accelerator. If the X-ray crystal structure analysis is carried out in the laboratory, the structure of the complex of C-GAT and N-terminal side of C-GAT is determined. The N-terminal side of the C-GAT is connected to the C-terminal side of the C-terminal side. Crystallization of C-GAT on the C-terminal side is related to the formation of C-GAT and the formation of C-GAT in solution. The N-terminal side of the C-GAT is different from the C-terminal side. The pull-down analysis is different from the C-terminal side. The maximum binding amount is different from the C-terminal side. The result of this is that the C-GAT is not the same as the C-GAT. The structure of the complex of GAT on the C-terminal side is still the same, and Mr. Kato's joint research on NMR analysis is still in progress. C-GAT in the NMR solution was identified by the combination of C-GAT and C-GAT on the N-terminal side. The results showed that the binding of C-GAT residues was important in the analysis of C-GAT residues.

项目成果

Yoko Shiba: "GAT(GGA and Tom1) Domain Responsible for Ubiquitin Binding and Ubiquitination"The Journal of Biological Chemistry. 279. (2004)

Yoko Shiba：“负责泛素结合和泛素化的 GAT（GGA 和 Tom1）结构域”《生物化学杂志》。