多機能アダプタータンパク質GGAの細胞内小胞輸送における役割

多功能衔接蛋白GGA在细胞内囊泡运输中的作用

基本信息

批准号：
03J00249
负责人：
芝陽子
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto University (2004)University of Tsukuba (2003)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J00249/
关键词：
GGA ユビキチン GAT

项目摘要

本年度は昨年明らかにしたGGA-GATドメインとユビキチンとの結合様式をより詳細に調べるために、高エネルギー加速器研究機構の若槻壮市先生、名古屋市立大学の加藤晃一先生らの研究室とともにC-GATドメインとユビキチンとの三次元構造を決定した。まず若槻研究室におけるX線結晶構造解析により、C-GATドメインのN末端側とユビキチンとの複合体の構造を決定した。しかし、C-GATのN末端側とユビキチンが結合するという構造は以前私が変異体解析により同定したC-GATのC末端側がユビキチンとの結合サイトになるという結果とは異なっていた。結晶ではC-GATのC末端側に関してはC-GAT同士のダイマー形成に関与しており、ユビキチンとは結合していないが、C-GATのダイマー形成は溶液中では起こっておらず、おそらく結晶化時のアーティファクトと思われる。そこでC-GATのN末端側およびC末端側にそれぞれ変異を入れた変異体、および両方に変異を入れた変異体を作成し、pull down解析およびBIACOREを用いた定量的な結合実験を行ったところ、いずれも一カ所の変異でも結合能あるいは最大結合量が落ちるが、両方に変異を入れた変異体でさらに結合能が下がることがわかった。この結果からC-GATドメインは二カ所でユビキチンと結合していることが示唆された。GATのC末端側とユビキチンとの複合体の構造が依然はっきりしなかったため、加藤晃一先生との共同研究によりNMRによる解析を行った。NMRでも溶液中でC-GATは二ヶ所でユビキチンと結合することが確認でき、またC-GATのN末端側に変異を入れた変異体とユビキチンとの結合様式を調べることにより、C-GATのC末端側とユビキチンとの結合様式を調べることができた。この結果以前私が同定したユビキチンとの結合に重要なC-GATのC末端側の残基が重要な働きをすることが、NMR解析においてもあきらかとなった。

在今年，为了更详细地调查去年揭示的GGA-GAT领域和泛素之间的约束模式，我们决定了C-GAT域和泛素的三维结构以及高能量促进研究所的Wakatsuki Toichi教授的实验室，高能量促进剂研究所和Kato Kato Kato Koichi Citions nagoya Cition nagoya City。首先，通过Wakatsuki实验室的X射线晶体学分析确定了C-GAT结构域和泛素的N末端之间的复合物结构。但是，泛素与C-GAT的N末端结合的结构与我先前通过突变分析鉴定的结果不同，其中C-GAT的C末端成为泛素的结合位点。在晶体中，C-GAT的C末端侧参与C-GAT之间的二聚体的形成，并且与泛素无结合，但是C-GAT中二聚体的形成并不发生在溶液中，并且很可能是结晶过程中的伪影。因此，我们在C-GAT的N末端和C端创建了突变体，并且在两者中都具有突变的突变体，并使用Biacore进行了下拉分析和定量结合实验。我们发现，在这两种情况下，即使在一个位置发生突变，结合能力或最大结合量也会降低，但是结合能力随着两者突变而进一步降低。这些结果表明，C-GAT结构域在两个位置与泛素结合。尚不清楚GAT和泛素C末端之间复合物的结构，因此NMR分析是与Kato Koichi教授合作进行的。 NMR证实，C-GAT在溶液中的两个位置与泛素结合，并通过检查C-GAT和泛素N末端的突变突变体之间的结合模式，我们能够检查C-GAT和泛素的C-末端之间的结合模式。结果，NMR分析表明，C-GAT的C末端残基，这对于与泛素结合至关重要，我先前鉴定出来，它起着重要作用。