分子設計とselection法の併用による新規機能性RNPの創製

结合分子设计和选择方法创建新型功能性 RNP

• 批准号: 03J05688
• 负责人: 松村 茂祥
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J05688/
• 关键词: 生命分子工学; 機能性核酸科学; ナノバイオテクノロジー; 分子設計; 進化分子工学; リボザイム

本研究の目的は、分子設計の手法と進化工学的手法を組み合わせた、合理的な機能性RNAの創製法を確立し、RNAの機能性分子としての潜在能力を追求することである。昨年度までに、当研究室で作製されたシス型リボザイムを分子モデリングの手法により改変し、新たなトランス型リボザイムを作製することに成功した。また、そのトランス型リボザイムを試験管内で進化させるための系を考案し、その構築を完了した。本年度は、この試験管内進化系を用いて、上記トランス型リボザイムの試験管内進化実験を行った。まず、昨年度までに構築したトランス型リボザイムの試験管内進化実験を行った。具体的には、トランス型リボザイムの基質認識モジュールをランダムな配列と置換した分子集団(ライブラリ)を作製し、そのライブラリを試験管内進化系に投入し、5ラウンドの試験管内進化実験を行った。その結果、2ラウンド目で微弱な活性が確認できたものの、それ以降のラウンドでの活性の濃縮が見られなかった。そこで、各ラウンドでの選択圧等を変更し、再度の試験管内進化実験を行ったところ、4ラウンドの選択操作で有意な活性の濃縮が確認できた。次に、4ラウンド後のライブラリをクローニングし各クローンの活性を測定したところ、プロトタイプと同程度の活性をもつクローンを数種類同定できた。しかし、その各クローンの塩基配列を決定したところ、ランダム化した基質認識モジュールの配列は元のプロトタイプと同一であった。この結果は、ランダム化したモジュールの配列空間内に、プロトタイプと同等あるいはそれ以上の性能をもつ配列が存在しないか、あるいは非常に少ないことを示唆している。そこで現在、ランダム化するモジュールを触媒モジュールに変更し、かつランダム配列をさらに長くすることで配列空間を広げたライブラリを新たに作製し、再度の試験管内進化実験を行っている。

The purpose of this research is to combine molecular design techniques and evolutionary engineering techniques, to establish a rational creation method for functional RNA, and to pursue the potential of RNA as a functional molecule. Last year, the research laboratory produced the されたシス type リボザイムをmolecule モデリングのThe technique is modified and the new たトランス type リボザイムを is made successfully.また, そのトランス type リボザイムをtrial tube inner でevolution させるためのsystem をtest case し, そのconstruct をcompleted した. This year's は, このtest tube evolution system を いて, the above-mentioned トランス type リボザイムのtest 験 within the tube evolution 実験を行った.まず, last year's までにconstructed したトランス-type リボザイムのtest験 in-tube evolution 実験を行った. Specific には, トランス type リボザイムの matrix recognition モジュールをランダムな arrangement and replacement した molecular set (ライブそのライブラリを trial tube evolution system にinvestment, 5ラウンドの trial trial tube evolution 実験を行った.その results, 2ラウンド目でweak activityがconfirmationできたものの,それ下注のラウンドでのActivityのconcentrationが见られなかった.そこで, each ラウンドでの选択姧wait を変 Update し, and try again the evolution in the tube 実験をThe operation of the line and the 4ラウンドのselection is intentional and the activity is concentrated and confirmed. Measurement of the activity of 4 ラウンド后のライブラリをクローニングしeach クローンのをThe active ingredients of the same degree and the same degree of active ingredients are the same number of types and types. The しかし, そのeach クローンの塩 radical arrangement をdetermination したところ, ランダム化The base of the base recognizes the base of the same base as the base of the base.このRESULTは、ランダム化したモジュールの in the arrangement spaceに、プロトタイプとequivalentあるいはThe performance above and beyond is the same as the existing one and the one that is very good.そこでNow, ランダム化するモジュールをcatalyst モジュールに変正し, かつランダムmatched arrangement をさらに长くすることでArrangement space を広げたライブラリを新たに成し、Re-test the evolution within the tube 実験を行っている.

项目成果

Shigeyoshi Matsumura: "Biochemical characterization of the kink-turn RNA motif."Nucleic Acids Research. 31(19). 5544-5551 (2003)

Shigeyoshi Matsumura：“扭结转角 RNA 基序的生化特征。”核酸研究。