染色体複製起点の同定とその制御機構の解明

染色体复制起点的鉴定及其控制机制的阐明

• 批准号: 15770005
• 负责人: 林田 敏郎
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15770005/
• 关键词: 複製; ゲノム; 免疫細胞; ヘルパーT細胞; competitive PCR; 複製起点

マウスのナイーブT細胞からIL-4/IL-13を発現するヘルパーT細胞タイプ2および、これらを発現しないヘルパーT細胞タイプ1に誘導する系を用いて、2種類のヘルパーT細胞におけるIL-4/IL-13遺伝子領域の複製起点の同定を、新生鎖DNAの量を定量する競合的PCR法を用いて行った結果、両細胞でIL-13遺伝子付近に複製起点活性が検出された。また、従来の新生鎖DNAの精製方法を改良し、この領域についてより詳細なマッピングを行ったところ、複製起点候補領域がIL-13遺伝子の第4エクソン内に存在することが明らかになった。未分化ES細胞についても同様の競合的PCRを行ったところ、ヘルパーT細胞と同じIL-13遺伝子領域に複製起点活性がみられた。以上の結果は、細胞の分化段階や遺伝子発現の状態に関係なく、このIL-13遺伝子領域に存在している複製起点は活性化している事を示唆している。また、ゲノムDNA全体に対する複製起点マッピングの方法として、DNA micro arrayによる解析は非常に有用だと考えちれるが、そのためにはDNA micro arrayに対するhybridizationのプローブとして使用可能な新生鎖DNAの精製方法の確立が必要だった。これまでの結果から、硫化セシウム密度勾配遠心法とショ糖濃度勾配遠心法の2種類の超遠心法を用いて精製した新生鎖DNAは、ゲノム全体に対する複製起点探索のためのDNA micro array hybridizationに用いるプローブとして充分に使用可能な品質であると考えている。今後は、得られた新生鎖DNAを偏り無く増幅することによって量的にも充分なものを確保するための方法を開発する予定である。

IL-4/IL-13 gene expression in T cells was detected by PCR. The results were as follows: (1) Identification of replication origin in IL-4/IL-13 gene domain and quantification of newly generated DNA in IL-4/IL-13 gene domain in T cells of two types were detected by PCR. IL-13 gene expression was detected near the origin of replication. The purification method of newly generated DNA was improved, and the results showed that there was a lot of DNA in IL-13 gene in the candidate domain. Undifferentiated ES cells contain the same type of PCR activity as IL-13 cells. These results indicate the relationship between the state of differentiation and gene development, and the existence and activation of replication in the IL-13 gene domain. The method of DNA purification using DNA microarrays is very useful. The results show that the density of sulfur is matched with the distance of sugar concentration, and the distance of two kinds of ultra-center is used to refine the DNA of the new lock, and the DNA microarray hybridization is used to explore the origin of replication. In the future, it is expected that methods will be developed to ensure that the amount of newly generated lock DNA obtained will increase without any delay.