植物細胞における新規輸送小胞形成機構に関する解析

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研究代表者は,高等植物における細胞内の輸送小胞の形成メカニズムを詳細に解明することを目的として,タバコ培養細胞BY-2を用いたin vitroでの小胞形成解析を行ってきた.これまでにおける研究から,タバコBY-2細胞から抽出した膜画分と細胞質画分に,ATPおよび加水分解しないGTPアナログを加え,30度で30分間保温することで,試験管内で小胞形成反応を再構成することに成功している.COPI小胞ならびにCOPII小胞の積み荷タンパク質と考えられるタバコSec22pの小胞画分への回収が,GTP固定型のアナログの存在によって促進されることから,COPIおよびCOPII小胞の形成が示唆されていた.今回,大腸菌から精製した野生型および優性阻害型変異タバコSar1pをin vitro小胞形成反応に添加した.しかしながら,いずれの場合にも小胞形成効率の顕著な変化は見られなかった.また,ラージスケールで行ったin vitro小胞形成反応の小胞画分の電子顕微鏡観察を行ったが、Sec22pが乗り,COPII状のコートをもった小胞は観察されなかった.以上の結果から,Sec22pのCOPII小胞による出芽の効率は,非常に低く,大部分はCOPII以外の小胞によることが明らかになった.また,細胞膜局在型H^+-ATPaseが,尿素処理した膜画分を用いて小胞形成反応を行った場合にも小胞画分に回収されたため,反応温度,反応時間,反応系のタンパク量などの条件を振りながら,反応の至適条件の検討を行った.その結果,温度に依存した小胞形成反応が起こることが明らかになった.また,その至適温度は30度であった.現在,この条件下で,系のラージスケール化をはかり,目的の小胞のフラクションを単離し,生化学的に解析しているが,今のところ小胞の同定および特定には至っていない.