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Na^+/H^+交換輸送蛋白質NhaAのpHセンサーおよびイオン交換輸送機構の解析

Na^+/H^+交换转运蛋白NhaA的pH传感器及离子交换转运机制分析

基本信息

批准号：
15770086
负责人：
井上弘樹
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

Na^+/H^+交換輸送蛋白質は細菌から高等動植物まで生物に広く存在し,細胞膜内外のNa^+とH^+を交換輸送することにより細胞内pHやNa^+濃度を調節する極めて重要な因子である。Na^+/H^+交換輸送蛋白質は推定アミノ酸一次配列の比較からいくつかのタイプに分類できるが,NhaAと呼ばれるタイプの輸送蛋白質は大腸菌を初め多く細菌から見出されており,アルカリpHで強く活性化を受ける。一方,H.pyloriのNhaA(HP NhaA)は他の細菌のNhaAと高い相同性を有しているにもかかわらず,pHによらず高い活性を有している。本研究で行ったHP NhaAに対するランダム変異導入による解析から,pH応答性には第4,8,10膜貫通領域(TM4,8,10)が,また基本的なイオン交換輸送活性にはTM4,5,10,11が深く寄与していることが明らかとなった。さらに,私は,イオン輸送とpH応答性の双方に関与するTM4領域についてシステイン走査変異法とN-ethylmaleimideによる修飾実験を行い,TM4領域がNhaA分子内で親水性の小孔の一部を形成していることを強く示唆するデータを得た。また,TM4が形成する親水性小孔の上端部には,疎水的な脂質膜貫通領域中に唯一存在する極性残基であるThr,Asp残基が存在しており,変異体のKm,Vmax値の変化からこれら残基がNa^+の結合部位の一部となっていることが明らかにした。一方で,HP NhaAの大腸菌内での大量発現・精製系,およびリポソームへの再構成系を構築した。この系を用い,HP NhaAについて速度論的解析およびpH依存性に関する詳細な検討を現在進行中である。

Na ^+/H^+ exchange transport proteins are important factors in regulating intracellular pH and Na^+ concentration in bacteria, higher plants and animals. Na^+/H^+ exchange transport proteins are presumed to be active in Escherichia coli and bacteria. On the one hand,H.pylori NhaA(HP NhaA) has high homology with other bacteria NhaA, and pH has high activity. In this study, HP NhaA was used to analyze the pH-responsive membrane penetration domains (TM4,8,10), and the basic membrane exchange and transport activities (TM4,5,10,11). In addition, in the TM4 domain, a part of the hydrophilic pore in the NhaA molecule is formed, which is related to both the transport and pH responsiveness and the modification of N-ethylmaleimide. In the upper end of the hydrophilic pore formed by TM4, Thr, Asp residues are the only polar residues present in the lipid membrane penetration domain of water. In the upper end of the hydrophilic pore, Thr,Asp residues are the only polar residues present in the lipid membrane penetration domain. In the upper end of the hydrophilic pore, Thr, Asp residues are the only polar residues present in the lipid membrane penetration domain. On the one hand,HP NhaA was produced in large quantities in Escherichia coli, and the purification system was constructed. The detailed discussion on the relationship between velocity theory and pH dependence of HP NhaA is in progress.