Na^+/H^+交換輸送蛋白質NhaAのpHセンサーおよびイオン交換輸送機構の解析

Na^+/H^+交换转运蛋白NhaA的pH传感器及离子交换转运机制分析

• 批准号: 15770086
• 负责人: 井上 弘樹
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15770086/
• 关键词: NhaA; イオン輸送; pH依存性; ナトリウムイオン; H.pylori; 大腸菌; システイン走査変異法; 精製 再構成

Na^+/H^+交換輸送蛋白質は細菌から高等動植物まで生物に広く存在し,細胞膜内外のNa^+とH^+を交換輸送することにより細胞内pHやNa^+濃度を調節する極めて重要な因子である。Na^+/H^+交換輸送蛋白質は推定アミノ酸一次配列の比較からいくつかのタイプに分類できるが,NhaAと呼ばれるタイプの輸送蛋白質は大腸菌を初め多く細菌から見出されており,アルカリpHで強く活性化を受ける。一方,H.pyloriのNhaA(HP NhaA)は他の細菌のNhaAと高い相同性を有しているにもかかわらず,pHによらず高い活性を有している。本研究で行ったHP NhaAに対するランダム変異導入による解析から,pH応答性には第4,8,10膜貫通領域(TM4,8,10)が,また基本的なイオン交換輸送活性にはTM4,5,10,11が深く寄与していることが明らかとなった。さらに,私は,イオン輸送とpH応答性の双方に関与するTM4領域についてシステイン走査変異法とN-ethylmaleimideによる修飾実験を行い,TM4領域がNhaA分子内で親水性の小孔の一部を形成していることを強く示唆するデータを得た。また,TM4が形成する親水性小孔の上端部には,疎水的な脂質膜貫通領域中に唯一存在する極性残基であるThr,Asp残基が存在しており,変異体のKm,Vmax値の変化からこれら残基がNa^+の結合部位の一部となっていることが明らかにした。一方で,HP NhaAの大腸菌内での大量発現・精製系,およびリポソームへの再構成系を構築した。この系を用い,HP NhaAについて速度論的解析およびpH依存性に関する詳細な検討を現在進行中である。

Na + / H ^ ^ + exchange transport protein は bacteria か ら higher plants and animals ま で biological に hiroo し く exist, inside and outside the cell membrane の Na + と H ^ ^ + を exchange conveying す る こ と に よ り intracellular pH や Na ^ + concentration を regulation す る extremely め て な factors で あ る. Na + / H ^ ^ + exchange transport protein は presumption ア ミ ノ acid a match column の is か ら い く つ か の タ イ プ に classification で き る が, NhaA と shout ば れ る タ イ プ の transport protein は coliform を め く bacteria more early か ら shows さ れ て お り, ア ル カ リ pH で strong く activeness を by け る. Side, H.p ylori の NhaA (HP NhaA) は he の bacterial の NhaA と high い phase gay を し て い る に も か か わ ら ず, pH に よ ら ず high い active を し て い る. This research line で っ た HP NhaA に す seaborne る ラ ン ダ ム - different import に よ る parsing か ら, pH 応 a sexual に は 4,8,10 transmembrane domain (TM4, 8, 10) が, ま た basic な イ オ ン exchange transport activity に は TM4, 5, 11 が deep く send し て い る こ と が Ming ら か と な っ た. は さ ら に, private, イ オ ン conveying と pH 応 both a sexual の に masato and す る TM4 field に つ い て シ ス テ イ ン walkthrough - different method と N - ethylmaleimide に よ る decorate be 験 を い, TM4 field が NhaA intramolecular で hydrophilic の holes の a を form し て い る こ と を く and shown strong sucking す る デ ー タ を た. ま た, TM4 が form す る hydrophilic pores の upper department に は, 疎 な lipid membrane water breakthrough in the field of the only existing す に る polar residues で あ る Thr, Asp residue が exist し て お り, - variant の Km, Vmax numerical の variations change か ら こ れ ら residues が Na ^ + の combining site の a と な っ て い る こ と が Ming ら か に し た. On one side, で, in HP NhaA <s:1> escherichia coli, a large number of で <e:1> are produced and refined lines,およびリポソ ムへ ムへ <s:1> are reconstituted lines を construct た た. こ の を use い, HP NhaA に つ い て speed theory of analytic お よ び pH dependency に masato す る detailed な beg を 検 now underway で あ る.

项目成果

Tsuboi, Y., Inoue, H., Nakamura, N., Kanazawa, H.: "Identification of membrane domains of the Na+/H+ antiporter(NhaA)Protein from Helicobacter pylori required for ion transport and pH sensing."J.Biol.Chem.. 278. 21467-21473 (2003)

Tsuboi, Y.、Inoue, H.、Nakamura, N.、Kanazawa, H.：“幽门螺杆菌中离子转运和 pH 传感所需的 Na /H 反向转运蛋白 (NhaA) 蛋白膜域的鉴定。”J.Biol

Mitsui, K., Ochi, F., Nakamura, N., Doi, Y., Inoue, H., Kanazawa H.: "A novel membrane protein capable of binding the Na+/H+ antiporter(Nha1p)enhances the salinity-resistant cell growth of Saccharomyces cerevisiae."J.Biol.Chem.. in press. (2004)

Mitsui, K.、Ochi, F.、Nakamura, N.、Doi, Y.、Inoue, H.、Kanazawa H.：“一种能够结合 Na /H 反向转运蛋白 (Nha1p) 的新型膜蛋白可增强抗盐性

Mitsui, K., Kamauchi, S., Nakamura, N., Inoue, H., Kanazawa, H: "A Conserved Domain in the Tail Region of the Saccharomyces cerevisiae Na+/H+ Antiporter(Nha1p) Plays Important Roles in Localization and Salinity-Resistant Cell-Growth."J.Biochem.(Tokyo). 13

Mitsui, K.、Kamauchi, S.、Nakamura, N.、Inoue, H.、Kanazawa, H：“酿酒酵母 Na /H 反转运蛋白 (Nha1p) 尾部区域的保守域在定位和盐度中发挥重要作用

Inoue, H., Nakamura, Y., Nagita, H., Takai, T., Masuda.M., Nakamura, N., Kanazawa, H.: "Calcineurin Homologous Protein Isoform 2(CHP2), Na^+/H^+ Exchangers--Binding Protein, Is Expressed in Intestinal Epithelium."Biol.Pharm.Bull.. 26. 148-155 (2003)

Inoue, H.、Nakamura, Y.、Nagita, H.、Takai, T.、Masuda.M.、Nakamura, N.、Kanazawa, H.：“钙调神经磷酸酶同源蛋白亚型 2(CHP2)，Na^ /H^

Nagita, M., Inoue, H., Nakamura, N., Kanazawa, H.: "Two Nuclear Export Signals Specify the Cytoplasmic Localization of Calcineurin B Homologous Protein 1."J.BIochem.(Tokyo). 134. 919-925 (2003)

Nagita, M.、Inoue, H.、Nakamura, N.、Kanazawa, H.：“两个核输出信号指定钙调磷酸酶 B 同源蛋白 1 的细胞质定位。”J.BIochem.（东京）。