リン酸化によるヘムオキシゲナーゼの機能調節機構の検討

通过磷酸化检查血红素加氧酶的功能调节机制

• 批准号: 15770073
• 负责人: 東元 祐一郎
• 金额: $ 1.86万
• 依托单位: Kurume University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15770073/
• 关键词: ヘムオキシゲナーゼ; NADPH-シトクロムP450還元酵素; リン酸化; コンピュータモデリング; 表面プラズモン共鳴法; 質量分析伝; ヘム代謝; 表面プラスモン共鳴法; 質量分析法; ペプチドマッピング

ヘムオキシゲナーゼ(HO)は、生理的なヘム代謝に与っているミクロソーム酵素で、ヘムを分解してビリベルジン、一酸化炭素および鉄イオンを生成する。反応に不可欠な電子は、同じミクロソーム酵素であるNADPH-シトクロムP450還元酵素(CPR)から供給される。HOの生理的役割としては、ヘムの分解に加え、ビリベルジンによる抗酸化作用や、COを介する情報伝達系への関与が示唆されている。本研究では、HOのリン酸化に着目し、HO関連タンパク質との相互作用によるHOの機能調節機構を検討した。タンパク質のリン酸化や、タンパク質間相互作用を検討するためには、高純度のタンパク質が大量に必要となるため、我々は、膜結合部分を排除したラットHO-1,HO-2及びCPRの大腸菌での高発現系を確立し、高純度の精製酵素を得た。さらにコンピュータプログラムとIn vitro kinase assayにより、HO-1上のThr^<188>がPKBによってリン酸化されることを明らかにした。そこで、リン酸化スレオニン模倣体として、Thr^<188>をアスパラギン酸に置換した変異酵素(T188D)を作成した。T188Dは、CPRを電子供給系として用いた場合、HO活性が野生型に比べ約1.5倍上昇することが明らかになった。そこで、変異酵素とCPRとの相互作用を表明プラズモン共鳴法を用いて検討した。まず野生型HOとCPRは、NADP^+が存在すると、そうでない場合に比べて約5倍強く結合することが知られた(Higashimoto et al., J.Biol.Chem., 280,729(2005)。一方、T188D変異酵素ではCPRとの結合が約2倍強く結合することが明らかになった。またドッキングモデルによる解析結果から、Thr^<188>のリン酸化、脱リン酸化がHOの活性制御に関与していることが示唆された。

ヘ ム オ キ シ ゲ ナ ー ゼ は (HO), physiological な ヘ に ム metabolism and っ て い る ミ ク ロ ソ ー ム enzyme で, ヘ ム を decomposition し て ビ リ ベ ル ジ ン, acidification carbon お よ び iron objects イ オ ン を generated す る. The 応 に not owe な electronic は, with じ ミ ク ロ ソ ー ム enzyme で あ る NADPH - シ ト ク ロ ム P450 enzyme (CPR) also yuan か ら supply さ れ る. HO の physical battle cut と し て は, ヘ ム の decomposition に え, ビ リ ベ ル ジ ン に よ る resistance acidification や, CO を dielectric す る intelligence 伝 da system へ の masato and が in stopping さ れ て い る. This study で は, HO の リ ン acidification に mesh し, HO masato even タ ン パ ク qualitative と の interaction に よ る HO の functional regulation institutions を beg し 検 た. タ ン パ ク qualitative の リ ン acidification や, タ ン パ ク qualitative interaction between を beg す 検 る た め に は, high purity の タ ン パ ク qualitative が a lot に necessary と な る た め, I 々 は, membrane combined with partial を exclude し た ラ ッ ト HO, HO - 2 and び CPR の coliform で の high purity and high を 発 now department established し の refining enzyme を た. さ ら に コ ン ピ ュ ー タ プ ロ グ ラ ム と In vitro kinase assay に よ り, HO - 1 の Thr ^ < 188 > が PKB に よ っ て リ ン acidification さ れ る こ と を Ming ら か に し た. そ こ で, リ ン acidification ス レ オ ニ ン mimic body と し て, Thr ^ < 188 > を ア ス パ ラ ギ ン acid に replacement し た - isoenzymes (T188D) を made し た. T188D は, CPR を electronic supply と し て in い た occasions, HO activity が is 1.5 times than the wild type に べ rise す る こ と が Ming ら か に な っ た. そ こ で, - isoenzymes と CPR と の を show that interaction between プ ラ ズ モ を ン resonance method with い て beg し 検 た. ま ず wild-type HO と は CPR, NADP ^ + が exist す る と, そ う で な に い occasion than べ て about 5 times stronger く combining す る こ と が know ら れ た (Higashimoto et al., J.B iol. Chem., 280729 (2005). One side, the T188D mutant enzyme で と CPRと <s:1> binding が is about twice as strong く binding する とが とが bright ら になった になった になった になった. ま た ド ッ キ ン グ モ デ ル に よ る analytical results か ら, Thr ^ < 188 > の リ ン acidification, リ ン acidification が HO の active suppression に masato and し て い る こ と が in stopping さ れ た.

项目成果

Sugishima, M.: "Crystal structure of rat heme oxygenase-1 in complex with biliverdin-iron chelate : Conformational change of the distal helix during the heme cleavage reaction."J.Biol.Chem.. 278(34). 32352-32358 (2003)

Sugishima, M.：“大鼠血红素加氧酶-1 与胆绿素-铁螯合物复合物的晶体结构：血红素裂解反应过程中远端螺旋的构象变化。”J.Biol.Chem.. 278(34)。

Hofseth, L.J.: "Nitric oxide-induced cellular stress and p53 activation in chronic inflammation."Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 100(1). 143-148 (2003)

Hofseth, L.J.：“慢性炎症中一氧化氮诱导的细胞应激和 p53 激活。”Proc.Natl.Acad.Sci.USA。

Shiseki, M.: "p29ING4 and p28ING5 bind to p53 and p300,and enhance p53 activity."Cancer Res.. 63(10). 2373-2378 (2003)

Shiseki, M.：“p29ING4 和 p28ING5 与 p53 和 p300 结合，并增强 p53 活性。”Cancer Res.. 63(10)。

Hydroxyamine and hydrazine bind directly to the heme iron of the heme-heme oxygenase-1 complex.

羟胺和肼直接与血红素-血红素加氧酶-1 复合物的血红素铁结合。

• 发表时间: 2004
• 期刊: J.Triorg. Biochem. 98(7)
• 作者: Sakamoto;H.
• 通讯作者: H.

Characterization of rat heme oxygenase-3. Implication of processed pseudogenes derived from heme oxygenase-2 gene.

大鼠血红素加氧酶 3 的表征。

• 发表时间: 2004
• 期刊: Gene 336(2)
• 作者: Hayashi;S.
• 通讯作者: S.