新規多機能型Na^+/H^+アンチポーターMrp複合体の構造と機能の解明

好アルカリ性BaCillus pseudofirmus OF4の新規複合体型Na^+/H^+アンチポーターMrpの生理的機能を明らかにするため、平成16年度は、以下のような実験を行ない、有用な結果を得た。まず、はじめにMrpシステムは二次能動輸送系のNa^+/H^+アンチポートを触媒し、さらに一次能動輸送モードを持っていると仮定されていた。この仮定は、大腸菌の呼吸鎖欠損変異株を用いた非発酵条件での生育でMrpに依存した相補が観察されたことが理由の一つであった。しかし、この相補には、大腸菌由来のリンゴ酸キノン酸化還元酵素の増加が関係し、Mrpの触媒活性ではないことを明らかにした。また、Mrpシステムの各サブユニットそれぞれのHis-tag融合タンパク質の発現、精製およびHis-tag抗体を用いたウエスタンブロットによる検出に成功した。また、各Mrpサブユニットに対するポリクローナル抗体を作製し、その検出を試みた。その結果、MrpEとMrpGに対するポリクローナル抗体以外の抗体を用いた場合は、各His-tag融合タンパク質をHis-tag抗体と同様にウエスタンブロットで検出することができた。検出できなかったMrpGに関しては、7つのサブユニットを同時に発現させる場合、His-tagやS-tagを付加して、発現させるので、複合体精製の実験でのウエスタンブロットでの検出に問題が生じなかったが、MrpEに関しては、現在、再度新しいポリクローナル抗体を作製中である。Mrp複合体の精製は、現在までに成功していないが、各サブユニットの一部にtagを付加し、活性に影響を与えないことを確認した発現プラスミドを構築したので、これを用いて大量精製をおこなう予定である。

好アルカリ性BaCillus pseudofirmus OF4の新規複合体型Na^+/H^+アンチポーターMrpの生理的機能を明らかにするため、平成16年度は、以下のような実験を行ない、有用な結果を得た。まず、はじめにMrpシステムは二次能動輸送系のNa^+/H^+アンチポートを触媒し、さらに一次能動輸送モードを持っていると仮定されていた。この仮定は、大腸菌の呼吸鎖欠損変異株を用いた非発酵条件での生育でMrpに依存した相補が観察されたことが理由の一つであった。しかし、この相補には、大腸菌由来のリンゴ酸キノン酸化還元酵素の増加が関係し、Mrpの触媒活性ではないことを明らかにした。また、Mrpシステムの各サブユニットそれぞれのHis-tag融合タンパク質の発現、精製およびHis-tag抗体を用いたウエスタンブロットによる検出に成功した。また、各Mrpサブユニットに対するポリクローナル抗体を作製し、その検出を試みた。その結果、MrpEとMrpGに対するポリクローナル抗体以外の抗体を用いた場合は、各His-tag融合タンパク質をHis-tag抗体と同様にウエスタンブロットで検出することができた。検出できなかったMrpGに関しては、7つのサブユニットを同時に発現させる場合、His-tagやS-tagを付加して、発現させるので、複合体精製の実験でのウエスタンブロットでの検出に問題が生じなかったが、MrpEに関しては、現在、再度新しいポリクローナル抗体を作製中である。Mrp複合体の精製は、現在までに成功していないが、各サブユニットの一部にtagを付加し、活性に影響を与えないことを確認した発現プラスミドを構築したので、これを用いて大量精製をおこなう予定である。