TIMバレル型酵素のN,C末端相互作用と安定性の相関と酵素の環状化による安定化

TIM 桶型酶的 N 端和 C 端相互作用与稳定性以及酶环化稳定化之间的相关性

基本信息

批准号：
15780078
负责人：
金子哲
金额：
$ 1.98万
依托单位：
National Food Research Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

Streptomyces olivaceoviridis E-86のファミリー10キシラナーゼの立体構造をもとに、4種類(変異体キシラナーゼ1〜4)の環状キシラナーゼをデザインした。環状キシラナーゼは、インテインを両端に持つ様に発現ベクターを構築し、大腸菌に形質転換し、タンパクの発現を行った。発現タンパクよりインテインを切り離し、キシラナーゼの環状化の反応を行い、SDS-PAGEに供して環状化反応の可否をチェックした。変異体キシラナーゼ1と2は推定分子量サイズの位置1本のバンドが確認され、N末端アミノ酸配列を解析したところ、デザインした変異体酵素のN末端配列に相当したことから、これら2つのキシラナーゼ変異体の環状化はうまく行かなかったと判断した。一方、変異体キシラナーゼ3と4に関しては、SDS-PAGE上で期待される分子量サイズの位置に2本のバンドが確認された。それらのN末端アミノ酸解析では高分子側のバンドのアミノ酸配列は解析できたが、低分子側の配列は確認できなかったことから、変異体キシラナーゼ3と4については環状化されたと判断した。そこで、4種類の変異体キシラナーゼの熱安定性を解析した。変異体キシラナーゼ1と2は、ほぼ同様の熱安定性を示しており、至適温度は50℃であった。これらの酵素は環状化がなされていないため、天然型酵素の至適温度60℃と比べ、熱安定性が低下していた。一方の変異体キシラナーゼ3と4に関しては、環状化されていることから、天然型より熱安定性が優れている事が期待されたが、至適温度は60℃であり、天然型酵素の至適温度と同じであった。

基于链霉菌链霉菌的三维结构Olivaceovirdis E-86，设计了四种类型（突变的二甲烷酶1-4）。构建环状木聚糖酶在两端具有内素，转化为大肠杆菌，并表达蛋白质。将内部素与表达的蛋白分离，并进行反应以环二甲酶化，并进行SDS-PAGE，以检查是否可能进行环化反应。对于突变的木聚糖酶1和2，确认了推导分子量大小的一个位置的条带，当分析了N末端氨基酸序列时，确定这两个二甲苯酶突变体的圆形化并不成功，因为它们对应于它们设计的突变酶的N末端序列。另一方面，对于突变的木聚糖酶3和4，在SDS-PAGE上预期的分子量大小确认了两个条带。这些N末端氨基酸分析允许分析聚合物侧的带的氨基酸序列，但是无法确认小侧的序列，因此确定突变的木聚糖酶3和4被循环。因此，分析了四个突变二甲酶的热稳定性。突变的木聚糖酶1和2表现出大致相似的热稳定性，最佳温度为50°C。由于这些酶未经循环，因此与60°C的天然酶的最佳温度相比，它们的热稳定性降低。另一方面，突变的木聚糖酶3和4的热稳定性比天然酶具有更好的热稳定性，因为它们是圆形的，但最佳温度为60°C，与天然酶的最佳温度相同。