自然界に学ぶ「バイオマス分解機構」の解明

阐明从自然界学到的“生物质分解机制”

基本信息

批准号：
21H02259
负责人：
金子哲
金额：
$ 11.23万
依托单位：
University of the Ryukyus
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

自然界における初期のバイオマス分解に関わる酵素を網羅的に解析するため、解読したイナワラを溶解させる能力を持つ放線菌のゲノム遺伝子配列からヘミセルロース分解に関わると予想された酵素遺伝子を網羅的にピックアップした。また、主要なヘミセルロースであるキシランの分解に関わる酵素であるキシラナーゼについては、すでにGH10とGH11の発現酵素が得られているため、バイオマスの分解性を評価した。これらGH10、GH11酵素については、立体構造も解析されていることから、顕微鏡観察のための蛍光ラベルを入れるために活性中心に関係しない部位にシステインを導入した変異体酵素、A164C（GH10), S64C（GH11）をそれぞれデザインした。また、サトウキビを材料として一分子観察が行えるか、既存の修飾酵素を用いてテストしたところ、バックグラウンドはあるもののAlexa647修飾酵素の１分子蛍光シグナルは観測することができた。ただし、試料の厚みがあるため１分子蛍光の焦点と明視野焦点がずれてしまうことや、試料が薄い場合は細胞構造が崩れてしまっているなど試料調製の問題や、酵素の非特異的吸着をどのように抑えるかが今後解決すべき問題として考えられた。後期のバイオマス分解に関わる酵素の網羅的解析に向けては、バイオマスを炭素源として担子菌を培養し、発現される酵素を観察し、バイオマス分解に重要と考えられる酵素を明らかにした。

为了全面分析涉及早期生物量降解的酶，我们已经全面选择了酶基因，这些酶基因有望从放线菌的基因组基因序列中涉及半纤维素降解，这些基因组具有溶解日本骨架的能力。此外，对于木聚糖酶，与二甲那样降解的一种酶（主要的半纤维素），由于已经获得了表达GH10和GH11的酶，因此评估了生物量降解性。由于还已经分析了这些GH10和GH11酶的三维结构，因此设计了突变酶A164C（GH10）和S64C（GH11）（GH11），在该酶中，将半胱氨酸引入了与活性中心无关的地点，以便将荧光标记放置在微观概念上。此外，当我们测试是否可以将甘蔗用作观察单个分子的材料时，尽管背景具有背景，我们仍能够观察Alexa647修饰的酶的单个荧光信号。然而，样品制备问题（例如由于样品的厚度而导致的单分子荧光从明亮的场焦点转移的重点，并且样品的细胞结构在样品稀薄时已损坏，以及将来需要解决的问题，例如如何抑制非特异性酶的吸附。为了对涉及晚期生物量降解的酶进行全面分析，使用生物量作为碳源培养了基础菌，并观察到表达的酶，揭示了人们认为对生物量降解很重要的酶。