サイトカイニン応答シグナル伝達の可視化:二成分制御因子間の構造と親和性相関解析

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平成15年度はレスポンスレギュレーター(RR)について、トウモロコシ由来(ZmRR)のアイソフォームZmRR1、ZmRR2の大量発現系の構築がうまくいかなかったため、平成16年度は、異なるアイソフォームの発現系の構築を目指した。その結果、アミノ末端にヒスチジンタグをつけたZmRR3について、大量のサンプルを確保することが可能となった。しかし、このアイソフォームは非常に不安定で、精製したその日から蛋白質が変性し始めていた。4℃で結晶化条件を検索したが、微結晶すら得ることができなかったため、蛋白質の安定化剤であるグリセロールやエチレングリコールをサンプルに添加し、同じく4℃で結晶化条件を検索してもうまくいかなかった。またアイソフォームのヒスチジンタグをプロテアーゼで除去することによって安定性の向上を目指したが、温度が低いとタグがうまく切れず、室温付近で酵素処理すると、アイソフォームがほとんど変性してしまうため、うまくいかなかった。酵母由来のhistidine phospho-transfer protein(HPt)とRRとの蛋白質-蛋白質複合体の立体構造の報告を元に、ドッキングシミュレーションプログラムを用いてトウモロコシ由来のHPt(ZmHP)とZmRRの複合体モデルの構築を試みた。ZmHPの立体構造は、結晶解析によって実験的に得られたものであるのに対して、ZmRRについては、ホモロジーモデリング法によってin silicoで得られたものであるため、得られたモデルについて、リン酸基を授受するヒスチジン(ZmHP)、アスパラギン酸(ZmRR)周辺を見ると、両蛋白質が接触するinterfaceに隙間が空いており、モデルとしての信頼性に疑問の余地がある。