未知の神経伝達機構を担うα-ラトロトキシン受容体の内因性リガンドの検索

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α-ラトロトキシンはセアカゴケグモ(Latrodectus mactans)の毒腺より単離された神経毒である。その作用機序は。哺乳類の神経シナプス前膜に局在する、リガンドが未知の細胞膜7回貫通型受容体CL1(calcium independent latrotoxin receptor (CIRL)/Latophilin 1)に特異的に結合し、神経終末より神経伝達物質の異常放出を促す。その結果、痛み,発汗,呼吸不全などの自律神経の失調をもたらす。α-ラトロトキシンによりもたらされる細胞内分泌顆粒放出のメカニズムは、細胞内外のカルシウムイオンに非依存的に生じることから、この放出がこれまで知られている経路とは異なる、未知の細胞内シグナル伝達系を介している可能性が強く示唆されている。本研究では、CL1の内在性リガンドを単離することにより、神経伝達を含めた細胞内分泌顆粒の放出の新たなメカニズムを明らかにし、神経系,内分泌系における生理的な機能と意義の解明を目的とする。これまでの研究では、細胞内サイクリックAMP(cAMP)濃度の増減をルシフェラーゼ活性でモニターできるよう、cAMP応答配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子を繋いだレポーター遺伝子を開発した。更にHEK293細胞とCHO細胞について、このレポーター遺伝子とCL1遺伝子を恒常的に発現する細胞株を樹立し、これらにラットの組織より抽出した生理活性ペプチド画分にて刺激を加えた。複数の画分において細胞株のcAMPを上昇させるものが認められたが、アミノ酸配列を解析したところ、既知のもの若しくは蛋白質が部分分解したものであった。そこで、これら偽陽性を早い段階で排除する目的と、受容体が似ているのならそのリガンドも相同性を持つであろうという予測のもとに、CL1と相同性のあるオーファン受容体CL2,CL3について同様の手法により細胞株を樹立した。これらに共通して反応する画分が最も可能性があるものではないかと考えていたが、検索の結果はこれまでと同様、既知蛋白質が分解したものが大部分であった。また未知のものについても、予想される塩基配列をもとにcDNAクローニングまで行ったが、分泌配列が見当たらず、生理活性ペプチドというよりも何らかの構成蛋白質と考えられるものであった。CL1,2,3が生理活性ペプチドの受容体であることはその構造から十分に予測できることから、恐らくこの結果はリガンドの組織含量が低いことが考えれる。そこで今後は、上記の細胞株を用いた検索を行うと共に、ラットの脳より単離した神経細胞にCL1,2,3とレポーター遺伝子を導入して検索を行うことを予定している。これら受容体は生体内では神経細胞に特異的に発現していることから、通常の細胞株よりも神経細胞を用いた場合の方が、より高感度で反応を検出できる可能性が考えられる。