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リアルタイム定量RT-PCR法を用いたオリエンチア・ツツガムシの遺伝子発現解析

实时定量RT-PCR法分析恙虫病东方体基因表达

基本信息

批准号：
15790225
负责人：
中山恵介
金额：
$ 2.24万
依托单位：
University of Miyazaki (2004)宮崎医科大学 (2003)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15790225/
关键词：
オリエンチア・ツツガムシリアルタイムRT-PCR 遺伝子発現解析

项目摘要

ダニ細胞と哺乳動物細胞内におけるオリエンチア遺伝子の発現パターンをリアルタイム定量RT-PCR法を用いて解析し、ダニ細胞中での共生のメカニズムや哺乳動物に対する病原性に関わる遺伝子群の検索を行うのが、本研究の狙いである。ゲノムの配列決定と解析の結果、オリエンチア菌のゲノム上には約2000個のORFが同定された。近縁菌種であるリケッチア属細菌との遺伝子比較解析の結果をもとに、これらのORFのうちから、1.菌の増殖に関わる(ハウスキーピング)遺伝子群、2.菌体表層蛋白質群、3.病原性に関わる可能性の高い4型分泌装置を構成する遺伝子群、4.菌体外への分泌蛋白質群をコードする遺伝子、また、5.オリエンチアゲノム中で高度に重複して存在する遺伝子群、を中心として、発現パターンを解析する250遺伝子を選択した。菌体構成蛋白質のプロテオーム解析の結果を参照しながら、第一段として84遺伝子についてTaqMan probeを作成した。残りの約170遺伝子に関しては、まずRT-PCRにより発現を確認した後、リアルタイム定量PCRの系へ持ち込むことにしている。冷凍保存菌体から抽出した総RNAを用いた予備実験を進めているが、ランダムプライマーを用いて行う予定であったRT-PCRは、得られるオリエンチア菌由来のRNA量が少なく、培養細胞由来RNAの影響が大きいことから、特異プライマーを用いた反応系への変更を検討している。また、マウスL細胞と蚊AeA12細胞を用いて、オリエンチア菌の培養細胞への吸着・侵入・細胞質定着・細胞室内増殖・出芽の各段階に至るタイムコースと細胞内菌数の変化を明らかにすると共に、新たにダニ由来の培養細胞とヒト毛細血管上皮細胞における培養条件の検討を行っている。

A quantitative RT-PCR method was used to analyze the expression of pathogenic genes in mammalian cells and mammalian cells. The results of the analysis of the sequence determination and the sequence determination of the ORFs in the genome were about 2000. The results of comparative analysis of the ORFs of the genus bacteria and the strains of the genus bacteria are as follows: 1. The growth of bacteria 2. Pathogenic surface protein group, 3. Pathogenic related high probability secretion device type 4 secretion device composition of the genetic subgroup, 4. In vitro secreted protein group, 4. In vitro secreted protein group, 5. Highly repeated in the presence of the genetic subgroup, center, discovery analysis of the genetic subgroup, 250. The results of the analysis of cell constituent proteins are referred to in the first paragraph and the TaqMan probe is prepared. About 170 genes were detected and identified by RT-PCR. The preparation of total RNA extracted from cryopreserved bacteria and the use of specific primers for predetermined RT-PCR can be seen. However, the amount of RNA derived from the bacteria obtained is relatively small, the influence of RNA derived from cultured cells is significant, and the use of specific primers for the reaction system is further discussed. The culture conditions of AeA12 cells in culture, adsorption, invasion, cytoplasmic colonization, cell interior propagation, budding, and intracellular bacterial count were discussed.