リアルタイム定量RT-PCR法を用いたオリエンチア・ツツガムシの遺伝子発現解析

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ダニ細胞と哺乳動物細胞内におけるオリエンチア遺伝子の発現パターンをリアルタイム定量RT-PCR法を用いて解析し、ダニ細胞中での共生のメカニズムや哺乳動物に対する病原性に関わる遺伝子群の検索を行うのが、本研究の狙いである。ゲノムの配列決定と解析の結果、オリエンチア菌のゲノム上には約2000個のORFが同定された。近縁菌種であるリケッチア属細菌との遺伝子比較解析の結果をもとに、これらのORFのうちから、1.菌の増殖に関わる(ハウスキーピング)遺伝子群、2.菌体表層蛋白質群、3.病原性に関わる可能性の高い4型分泌装置を構成する遺伝子群、4.菌体外への分泌蛋白質群をコードする遺伝子、また、5.オリエンチアゲノム中で高度に重複して存在する遺伝子群、を中心として、発現パターンを解析する250遺伝子を選択した。菌体構成蛋白質のプロテオーム解析の結果を参照しながら、第一段として84遺伝子についてTaqMan probeを作成した。残りの約170遺伝子に関しては、まずRT-PCRにより発現を確認した後、リアルタイム定量PCRの系へ持ち込むことにしている。冷凍保存菌体から抽出した総RNAを用いた予備実験を進めているが、ランダムプライマーを用いて行う予定であったRT-PCRは、得られるオリエンチア菌由来のRNA量が少なく、培養細胞由来RNAの影響が大きいことから、特異プライマーを用いた反応系への変更を検討している。また、マウスL細胞と蚊AeA12細胞を用いて、オリエンチア菌の培養細胞への吸着・侵入・細胞質定着・細胞室内増殖・出芽の各段階に至るタイムコースと細胞内菌数の変化を明らかにすると共に、新たにダニ由来の培養細胞とヒト毛細血管上皮細胞における培養条件の検討を行っている。