スフィンゴ脂質による心筋障害の軽減効果の検討

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初年度は新生児ラット心筋細胞を用いた培養心筋細胞における低酸素再酸素化障害に対するShingosine 1-phosphate (S1P)の効果を調べた。まず我々の有する培養システムで新生児ラット心筋細胞培養の至適化を行った。その結果cold trypsinおよびcollagenaseを用いた単離方法の内最も適切な手順・時間等を決定した。その後48-72時間培養し実験に供した。なお、実験前にfibroblastのcontaminationを排除する目的でdifferential platingを行っている。その後低酸素チェンバーを用いて細胞に対し12時間低酸素、12時間再酸素負荷を行った。その際にも種々の低酸素時間、再酸素化時間、また酸素濃度の至適化を細胞のviability assayをMTS dyeを用いて行った。アポトーシスの評価としては、従来我々が行ってきた螢光色素を用いたTUNEL staining、Hoechst 33258による核の染色を用いて評価したところ、低酸素-再酸素化負荷によりアポトーシスを生じた細胞は5%から25%に増加した。それに対して、S1Pを前投与した群では有意にアポトーシスを抑制した。また細胞のcytosolic fraction中のDNA fragmentationを用いて検出したデータでも同様の傾向を認めた。さらには他の心筋細胞アポトーシス誘導モデルを用いて同薬物の効果の検討を行っている。H_2O_2(100μM)、Doxoruicin(1μM)によりアポトーシスを誘導し、S1Pを投与群と非投与群とで以下の項目について検討を現在行っている。またこれらのアポトーシス抑制機序してProapoptotic proteinによるミトコンドリアよりcytochrome cの放出等の調節を評価することが極めて重要であるが、これらの放出をさらに調節しているbcl-2や、さらにはXIAPのタンパク発現に及ぼすS1Pの効果を検討するため、各群のタンパク質を抽出した。以上より、S1Pが心筋の低酸素-再酸素化や酸化ストレスによる障害に対して保護作用を有することが示された。