脳虚血における低酸素誘導因子とヘムタンパク・ニューログロビンの動態解析

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脳虚血モデルの確立総頸動脈結紮法によりマウス脳虚血モデル作成を試みたが、安定したモデル確立はできなかった。代替案として低濃度酸素への長期暴露を用いた実験系を構築した。低酸素誘導因子とニューログロビンの発現解析初年度より低酸素誘導因子とニューログロビンの発現をノザンハイブリダイゼーションで解析するためのプローブを作成してきた。RT-PCRで増幅するためにプライマーを合成委託した。これを用いてプローブとして用いるcDNAを増幅し、現在プラスミドにサブクローニングしており、シーケンスによるcDNAの配列を確認後、ノザンハイブリダイゼーションにより発現解析が可能となる(組換えDNA実験計画承認済み)。低酸素誘導因子の発現状態をタンパクのレベルで解析(ウエスタンブロット)するための抗体は複数の会社より市販されたため、一次抗体、二次抗体、ラベル方法に関して最適なものを検討し、試験的にウエスタンブロットを行った。また実験計画当初ニューログロビンの抗体は市販されていなかったが、昨年度テキサスサウスウエスタンメディカルセンターより作製配布されたため、これを使用する予定であった。しかし供給体制に不備があり、今後の配布の目処が立たないためニューログロビンのウエスタンブロットは中止し、mRNAの解析を優先した。今後ニューログロビンの抗体が入手できた場合に、迅速に虚血時のニューログロビンの発現実験が行えるよう予備実験を行った。