妊婦末梢血に浮遊するmRNAの同定とそれを用いた絨毛機能評価法の開発

孕妇外周血中漂浮mRNA的鉴定及其评价绒毛功能的方法的建立

• 批准号: 15790913
• 负责人: 本間 進
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Showa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15790913/
• 关键词: 妊娠高血圧症候群; 胎盤由来mRNA; 胎盤機能評価; cell-free mRNA; 胎盤; 絨毛機能評価; 妊婦抹消血; mRNA; 胎盤機能; 絨毛細胞; hCG; hPL; 遺伝子発現; 妊婦血漿; 妊娠中毒症; real-time PCR

妊娠6週から40週の正常妊婦末梢血をEDTA加に採血し、3000rpmにて2回遠沈後の血漿成分を-20℃で凍結保存した。血漿1.6mlにTrizol-Lsを加え、よく混和した後、水層を分取し、それに70%エタノールを等量加えてQIAamp MiniElute Columnに吸着させた後、20μl中にRNAを溶出した。mRNAは逆転写後、TaqMan PCRで各遺伝子発現量を定量化した。血漿中βhCG,hPLの蛋白濃度はRIA固相法、ラテックス凝集免疫法で測定した。その結果、母体血漿中βhCG遺伝子発現量は妊娠6-15週の全例で定量できた。妊娠22週以降、βhCG遺伝子発現は15/53(28.3%)で検出感度以下であり、検出できた症例もその濃度は低かった。母体血漿中βhCG遺伝子発現量はβhCG蛋白濃度と正の相関(r=0.840,p<0.001)を示した。また、その濃度はβhCG蛋白濃度と同様、妊娠10週頃ピークを示し、妊娠22週以降は低値であった。また、母体血漿中hPL遺伝子発現量も全例で定量することができ、遺伝子発現量と蛋白濃度は正の相関(r=0.739,p<0.001)を示した。さらに、hPL遺伝子は分娩翌日には検出できなかった。胎盤由来と考えられるmRNAとしてHLA-G遺伝子に着目していたが、至適なプライマー・プローブの作成ができなかったために、βhCG・hPLを標的とした。胎盤で選択的に遺伝子発現しているβhCG、hPLを標的とし、母体血漿中で胎盤のmRNAの発現量が評価できることを確認した。母体血漿中βhCG、hPL遺伝子発現量が母体血漿中蛋白濃度と相関を示したことは、(1)母体血漿中のmRNAが比較的安定した状態で血漿中を循環していること、(2)母体血漿中の様々な他のmRNAを定量することで胎盤の生化学的変化を直接評価可能なことを示唆している。以上のことから、妊娠中毒症などの胎盤が病態形成に主要な役割を果たしている疾患の無侵襲な病態評価法として、母体血漿中mRNAの定量が有用であると考えられた。

Blood samples were collected from the peripheral blood of normal pregnant women from 6 weeks to 40 weeks of gestation, and the plasma components were frozen at-20℃ after 2 cycles at 3000rpm. 1.6 ml of plasma was added to the solution, and after mixing, the aqueous layer was separated, and 70% of the solution was added to the QIAamp MiniElute Column. After adsorption, 20μl of RNA was dissolved. After mRNA reverse transcription, TaqMan PCR quantifies the expression of each gene.βhCG and hPL protein concentrations in plasma were determined by RIA solid phase method and RIA agglutination immunoassay. Results: βhCG gene production in maternal plasma was quantified in all cases at 6-15 weeks of gestation. After 22 weeks of gestation, βhCG gene was detected in 15/53(28.3%) of cases with low sensitivity and low concentration.β-hCG gene production in maternal plasma was positively correlated with β-hCG protein concentration (r= 0.840, p <0.001). The concentration of βhCG protein was the same at 10 weeks of gestation and decreased at 22 weeks of gestation. There was a positive correlation between hPL gene expression and protein concentration (r= 0.739, p <0.001). The day after the birth of the child, the child will be born. The origin of placenta is examined by mRNA and hLA-G gene expression. The expression of hCG and hPL in placenta mRNA and the expression of placental mRNA in maternal plasma were evaluated.βhCG and hPL mRNA levels in maternal plasma are correlated with maternal plasma protein concentrations,(1) mRNA levels in maternal plasma are relatively stable and circulating in plasma,(2) mRNA levels in maternal plasma are quantified, and changes in placental biochemistry may be directly evaluated. The above results are useful for evaluating the pathogenesis of pregnancy toxemia and for quantifying mRNA in maternal plasma.

项目成果

Fragmentation of cell-free fetal DNA in plasma and urine of pregnant women

• DOI: 10.1002/pd.1213
• 发表时间: 2005-07-01
• 期刊: PRENATAL DIAGNOSIS
• 影响因子: 3
• 作者: Koide, K;Sekizawa, A;Okai, T
• 通讯作者: Okai, T