プロテオミクスの手法によるシロイヌナズナ花粉管伸長機構の解明

利用蛋白质组学技术阐明拟南芥花粉管伸长机制

• 批准号: 04F04172
• 负责人: 木下 修一
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04F04172/
• 关键词: シロイヌナズナ; 花粉; 授精; プロテオミクス; プロテインキナーゼ; 受精; 蛋白質リン酸化酵素

植物の授精は、雌しべの柱頭に着いた花粉が発芽し、花粉管が伸長して胚珠に到達して起こる。花粉-雌しべ間の相互作用により引き起こされる外的/内的シグナルを介して、数多くの蛋白質が、花粉管の発芽・伸長を促進したり抑制したりしてこの過程を制御している。これらのシグナルやその伝達系路についてはまだ不明な部分が多い。そこで、我々は、シロイヌナズナ花粉の蛋白質をプロテオミクスの手法を用いて解析することで、花粉管伸長や、授精に関わる重要な蛋白質を同定することを目的として研究を行った。シロイヌナズナ約3000花分の花粉より蛋白質を抽出し、二次元電気泳動で展開、PVDF膜に転写後CBBで染色し、35のメインスポットを得た。これらをトリプシン消化後、質量分析計(LC MS/MS)で解析したところ、21のスポットについて、シロイヌナズナ蛋白質と同定できた。また、シロイヌナズナにおいて、タバコのプロテインキナーゼPK1、PK2と高い相同性を持つ遺伝子のクローニングも行った。このタバコのキナーゼは、花粉/花粉管で特異的に発現しており、花粉の発生や花粉管伸長に重要な役割をしていると考えられている。RT-PCRの結果、シロイヌナズナでも、このキナーゼは、葉や根にはなく、花でのみ発現していた。次に、このキナーゼと、花粉/管内での役割がよく研究されているRop1遺伝子をGST融合タンパク質として大腸菌で発現させた。発現蛋白質は精製が困難であったため、C末端にStrep tag2を付加させた別の発現ベクターも構築し、現在発現蛋白質の精製を行っている。以下、アフィニティキャプチャー法により、精製したGST融合蛋白質と相互作用する花粉蛋白質をSDS-PAGEで分析し、特異的なスポットについてはゲル内消化後、MS/MS解析で同定、遺伝子のクローニング、構造解析を行う予定である。同様の方法で、タバコのPK1、PK2のGST融合タンパク質について、タバコ花粉抽出液中に、相互作用する蛋白質を検索した。特異的なスポットがいくつか観察され、MSで解析を行ったところ、elongation factor、メチオニン合成酵素、ヒートショック蛋白質が同定された。確認のため、再度実験を行っている。タバコ、シロイヌナズナ双方の結果を比較することで、このシグナル伝達系についてより信頼性の高い情報が得られると期待される。

The plant is fertilized, the female stigma is filled with pollen, and the pollen tube is elongated, and the ovule reaches the ovule. Pollen-Female Interaction により attraction きrise こされるOutside/Inside シグナルを Introduction して, Number of Lots くProtein, pollen tube buds and elongation promote and inhibit the process of pollen tube elongation.これらのシグナルやその伝道道についてはまだUnknown partが多い.そこで、我々は、シロイヌナズナ PollenのproteinをプロテオミクスのtechniqueをUse いて to analyze することで、Pollen tube elongation や、Important protein for fertilization なを Same determination することをPurpose としてResearch を行った. About 3,000 flower cents of シロイヌナズナのpollen and よりprotein are extracted, 2D electrophoresis is developed, PVDF membrane is written and CBB is dyed, and 35 のメインスポットを is obtained. After digestion, mass analyzer (LC MS/MS) analysis of 21のスポットについて, シロイヌナズナprotein and the same determination of できた.また、シロイヌナズナにおいて、タバコのプロテインキナーゼP K1, PK2 is the same as the high one.このタバコのキナーゼは, pollen/pollen tube specific に発appears しており, The growth of pollen and the elongation of pollen tubes are important. RT-PCR results, シロイヌナズナでも, このキナーゼは, leaf root にはなく, flower でのみ発appears していた. Second time, pollen/tube cutting, pollen research, and pollen research. Rop1 genetic material をGST fusion タンパク性として coliform bacteria で発 appear させた.発 appear protein is difficult to purify, C-terminal Strep tag2 is added and させたbie の発appears ベクターもconstructs し, 発appear protein is refined and is OK. The following is analysis of the アフィニティキャプチャー法により, purified GST fusion protein and interaction pollen protein をSDS-PAGEし、Specific なスポットについてはゲル internal digestion, MS/MS analysis is the same, the remaining のクローニング, the structural analysis is done and the である is determined. The same methods as PK1 and PK2 are the same as the GST fusion of タンパク性について, タバコpollen extract liquid, and the interaction するprotein を検SO した. Special analysis of the problem, elongation factor, メチオニン synthesis enzyme, ヒートショックprotein が同定された. Confirmation and confirmation again.タバコ、シロイヌナズナThe results of both sides are comparedすることで、このシグナル伝大组についてより信格性の高いInformationが gotられるとLooking forward to it.