ベルベリン生合成系におけるシトクロームP450遺伝子の構造と機能

小檗碱生物合成系统中细胞色素P450基因的结构和功能

基本信息

批准号：
04J01295
负责人：
池澤信博
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

ハナビシソウ培養細胞cDNAから単離していたCYP719A2、CYP719A3の機能解析を詳細に行った。これまでに、CYP719A2、CYP719A3は(R, S)-cheilanthifolineと(S)-scoulerineを基質とする事、CYP719A3は(S)-tetrahydrocolumbamineをも基質とする事が示されていた。今回CYP719A2、CYP719A3の基質特異性について、より多種(8種類)のイソキノリンアルカロイドを用いて解析を行った結果、いずれの化合物も基質とはならないことが示され、CYP719A2、CYP719A3の基質特異性は比較的高い事が明らかとなった。また、CYP719A2、CYP719A3のP450としての性質を調べた所、これらのP450が行うメチレンジオキシ環形成反応は酸素要求性である事が明らかとなった。これまでに、cheilanthifolineとscoulerineを等濃度混合してCYP719A2、CYP719A3反応を行った結果から、CYP719A2はcheilanthifoline特異的である一方で、CYP719A3は両者をほぼ同程度基質とする事が明らかとなっていた。そこで今回、これらのP450のscoulerineに対するKm値を測定した所、CYP719A2のKm値は32.3μMであり、CYP719A3のKm値は0.54μMと大きな違いが認められ、この違いが基質特異性に反映されていると考えられた。CYP719A2、CYP719A3はアミノ酸配列の相同性が84.6%と高いが、基質特異性ならびにscoulerineに対する基質親和性において違いを示したことから、一次構造と基質特異性の関係を解析する良い材料であると考えられた。また、上記以外の新規なP450遺伝子(C-C結合活性を有していた)の機能解析を進めた。

从日本百合的日本百合培养的cDNA中分离出的CYP719A2和CYP719A3的功能分析。现在已经显示出CYP719A2和CYP719A3使用（R，S） - cheilanthifoline和（S） - 霉菌作为底物，而CYP719A3也使用（S） - trahydrohydrocolembomine作为底物。使用较大品种（8种）等异喹啉生物碱的CYP719A2和CYP719A3的底物特异性分析表明，这些化合物都不是底物，并且揭示了CYP719A2和CYP719A3的底物特异性。此外，当我们研究CYP719A2和CYP719A3的特性为P450时，据揭示了这些P450S进行的甲基二氧环形成反应是氧气需要的。到目前为止，通过将Chielanthifoline和Scoulerine混合以相等的浓度进行CYP719A2和CYP719A3反应，并且已经发现CYP719A2是Cheilanthifoline特异性的，而CYP719A3是Cyilanthifoline特异的。因此，当我们测量这些P450的Scouureine的KM值时，CYP719A2的KM值为32.3μm，CYP719A3的KM值为0.54μm，认为这在底物特异性中被认为反射。尽管CYP719A2和CYP719A3的氨基酸序列同源性为84.6％，但它们显示出底物特异性和Scoulerine的底物亲和力差异，被认为是分析主要结构和底物特异性之间关系的良好材料。此外，除上述新型P450基因（具有C-C结合活性）的功能分析还进行了。