mRNAのプロセシングと輸送の1分子蛍光イメージング

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mRNAの動態を指標とした核内ドメインspeckleの機能解明に取り組んだ。in vitroで合成した蛍光標識Drosophila Fushitarazu mRNAをCos7細胞の核内にマイクロインジェクションにより導入し、mRNAのspeckleへの局在がイントロン配列依存的であることを示した。導入したmRNAの核外輸送及びスプライシング活性をRT-PCRにより確認し、speckleでのFRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)及びiFRAP (inverse FRAP)を試みた。細胞内の任意の領域を退色させる照明手法としてDMD (Digital Micromirror Device)を採用し、これを導入した蛍光顕微鏡システムを構築した。FRAPによりmRNA分子のspeckleへの流入速度を測定した(τ=10sec)。この際、蛍光回復が7割程度に留まりmRNA分子に静的な成分が含まれることが示された。続いてiFRAPにより、mRNA分子のspeckleからの流出速度を測定した(τ=100sec)。蛍光減衰においても3割の静的な成分が検出された。よりspeckleの機能を明らかにするため、5' splicing siteに存在する重度保存配列を置換(GT→AC)したスプライシング反応阻害変異体を作製した。wild-typeと同様にspeckleへの局在が観察されたが、核外輸送に顕著な阻害が見られた。iFRAPでは、wild-typeに比べて静的な成分の割合が増加した。この結果、speckleからのmRNA分子の解離がスプライシング反応と連携した過程であることが示された。これにより、従来提案されてきた「speckleはスプライシング反応における因子の会合、貯蔵の場である」とする消極的な寄与モデルより積極的な関与を示すことができた。