膜タンパク質活性のQCM上でのin situ解析系の構築

膜タンパク質はその取り扱いの難しさから、定量的な解析はあまり行われていない。そこで、本研究では膜タンパク質をより定量的に解析するために、水晶発振子マイクロバランス法を用いた解析系の構築を目指した。タンパク質の分泌や膜タンパク質の脂質膜内への埋め込みにおいて重要な働きをもっているSecYEという膜貫通型タンパク質をターゲットとした。より安定で取り扱いが容易な高度好熱菌由来のTSecYEとTSecYEと相互作用しタンパク質の膜透過行うタンパク質であるTSecAの発現・調製を行った。そして、TSecAを部位特異的にbiotin化してAvidinを吸着させた水晶発振子の基板上に固定化し、界面活性剤中において高度好熱菌のTSecYEおよびアミノ酸をタンデムにつないで発現させたdimer状態のTSecYYEとの相互作用解析を行った。その結果、TSecYEはdimer状態をとることでTSecAと強く相互作用するようになり、TSecAとTSecYEとの結合は1:2の割合で起こることが示唆された。より天然に近い状態で解析を行うため、膜タンパク質が脂質膜に埋め込まれた状態において基板上に固定化できるように2つの方法を検討した。1つは、界面活性剤中で精製された膜タンパク質を部位特異的に修飾し、その修飾部位を利用して基板に固定化し、その後界面活性剤を脂質膜に置換する方法である。2つめは、基板に脂質分子を固定化し、固定化した脂質分子をアンカーとして脂質膜と膜タンパク質を基板上で再構成する方法である。前者の方法では膜タンパク質の配向性と固定化密度を制御した生体膜の再構成ができ、後者では膜タンパク質の流動性を確保した生体膜の固定化が行え、それぞれ一長一短をもつ2つの固定化方法が確立できたと考えられ、今後いろいろな膜タンパク質の機能解析に適用されることが期待される。

膜タンパク質はその取り扱いの難しさから、定量的な解析はあまり行われていない。そこで、本研究では膜タンパク質をより定量的に解析するために、水晶発振子マイクロバランス法を用いた解析系の構築を目指した。タンパク質の分泌や膜タンパク質の脂質膜内への埋め込みにおいて重要な働きをもっているSecYEという膜貫通型タンパク質をターゲットとした。より安定で取り扱いが容易な高度好熱菌由来のTSecYEとTSecYEと相互作用しタンパク質の膜透過行うタンパク質であるTSecAの発現・調製を行った。そして、TSecAを部位特異的にbiotin化してAvidinを吸着させた水晶発振子の基板上に固定化し、界面活性剤中において高度好熱菌のTSecYEおよびアミノ酸をタンデムにつないで発現させたdimer状態のTSecYYEとの相互作用解析を行った。その結果、TSecYEはdimer状態をとることでTSecAと強く相互作用するようになり、TSecAとTSecYEとの結合は1:2の割合で起こることが示唆された。より天然に近い状態で解析を行うため、膜タンパク質が脂質膜に埋め込まれた状態において基板上に固定化できるように2つの方法を検討した。1つは、界面活性剤中で精製された膜タンパク質を部位特異的に修飾し、その修飾部位を利用して基板に固定化し、その後界面活性剤を脂質膜に置換する方法である。2つめは、基板に脂質分子を固定化し、固定化した脂質分子をアンカーとして脂質膜と膜タンパク質を基板上で再構成する方法である。前者の方法では膜タンパク質の配向性と固定化密度を制御した生体膜の再構成ができ、後者では膜タンパク質の流動性を確保した生体膜の固定化が行え、それぞれ一長一短をもつ2つの固定化方法が確立できたと考えられ、今後いろいろな膜タンパク質の機能解析に適用されることが期待される。