膜タンパク質活性のQCM上でのin situ解析系の構築

膜蛋白活性QCM原位分析系统的构建

基本信息

批准号：
04J04667
负责人：
三友秀之
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

膜タンパク質はその取り扱いの難しさから、定量的な解析はあまり行われていない。そこで、本研究では膜タンパク質をより定量的に解析するために、水晶発振子マイクロバランス法を用いた解析系の構築を目指した。タンパク質の分泌や膜タンパク質の脂質膜内への埋め込みにおいて重要な働きをもっているSecYEという膜貫通型タンパク質をターゲットとした。より安定で取り扱いが容易な高度好熱菌由来のTSecYEとTSecYEと相互作用しタンパク質の膜透過行うタンパク質であるTSecAの発現・調製を行った。そして、TSecAを部位特異的にbiotin化してAvidinを吸着させた水晶発振子の基板上に固定化し、界面活性剤中において高度好熱菌のTSecYEおよびアミノ酸をタンデムにつないで発現させたdimer状態のTSecYYEとの相互作用解析を行った。その結果、TSecYEはdimer状態をとることでTSecAと強く相互作用するようになり、TSecAとTSecYEとの結合は1:2の割合で起こることが示唆された。より天然に近い状態で解析を行うため、膜タンパク質が脂質膜に埋め込まれた状態において基板上に固定化できるように2つの方法を検討した。1つは、界面活性剤中で精製された膜タンパク質を部位特異的に修飾し、その修飾部位を利用して基板に固定化し、その後界面活性剤を脂質膜に置換する方法である。2つめは、基板に脂質分子を固定化し、固定化した脂質分子をアンカーとして脂質膜と膜タンパク質を基板上で再構成する方法である。前者の方法では膜タンパク質の配向性と固定化密度を制御した生体膜の再構成ができ、後者では膜タンパク質の流動性を確保した生体膜の固定化が行え、それぞれ一長一短をもつ2つの固定化方法が確立できたと考えられ、今後いろいろな膜タンパク質の機能解析に適用されることが期待される。

由于处理膜蛋白的困难，定量分析的执行量却没有太多。因此，在这项研究中，我们旨在使用石英晶体振荡器微量平衡法构建一个分析系统，以便对膜蛋白进行更多定量分析。我们瞄准了一种称为secye的跨膜蛋白，该蛋白在将蛋白质和嵌入膜蛋白嵌入脂质膜中具有重要作用。进行了TSECA的表达和制备，一种源自高度嗜热细菌和Tsecye的蛋白质，与蛋白质可渗透的蛋白质膜相互作用，更稳定，更易于处理。然后，TSECA通过将其固定在石英振荡器的底物上而被特异性生物素化和抗原吸附，并使用高度嗜热细菌Tsecye进行相互作用分析，并通过将Tandem tandem tandem confranfictantsantants表达出来。结果，TseCye通过取二聚体状态与TSECA强烈相互作用，表明TSECA和TSECYE之间的结合以1：2的比率发生。为了以更自然的状态进行分析，研究了两种方法，以便将膜蛋白固定在脂质膜中时可以固定在底物上。一种方法是，在表面活性剂中纯化的膜蛋白是特定于位点修饰的方法，其位点用于将其固定在底物上，然后用脂质膜代替表面活性剂。第二种方法涉及将脂质分子固定在底物上，并使用固定的脂质分子作为锚固，脂质膜和膜蛋白在底物上重建。前一种方法允许重建具有膜蛋白的方向和固定密度的生物膜，而后者则允许固定生物膜的固定化，以确保膜蛋白的流动性，并且人们认为两种固定方法已被建立，并在各种启发方面都可以分析。将来的蛋白质。