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膜タンパク質活性のQCM上でのin situ解析系の構築

膜蛋白活性QCM原位分析系统的构建

基本信息

批准号：
04J04667
负责人：
三友秀之
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

膜タンパク質はその取り扱いの難しさから、定量的な解析はあまり行われていない。そこで、本研究では膜タンパク質をより定量的に解析するために、水晶発振子マイクロバランス法を用いた解析系の構築を目指した。タンパク質の分泌や膜タンパク質の脂質膜内への埋め込みにおいて重要な働きをもっているSecYEという膜貫通型タンパク質をターゲットとした。より安定で取り扱いが容易な高度好熱菌由来のTSecYEとTSecYEと相互作用しタンパク質の膜透過行うタンパク質であるTSecAの発現・調製を行った。そして、TSecAを部位特異的にbiotin化してAvidinを吸着させた水晶発振子の基板上に固定化し、界面活性剤中において高度好熱菌のTSecYEおよびアミノ酸をタンデムにつないで発現させたdimer状態のTSecYYEとの相互作用解析を行った。その結果、TSecYEはdimer状態をとることでTSecAと強く相互作用するようになり、TSecAとTSecYEとの結合は1:2の割合で起こることが示唆された。より天然に近い状態で解析を行うため、膜タンパク質が脂質膜に埋め込まれた状態において基板上に固定化できるように2つの方法を検討した。1つは、界面活性剤中で精製された膜タンパク質を部位特異的に修飾し、その修飾部位を利用して基板に固定化し、その後界面活性剤を脂質膜に置換する方法である。2つめは、基板に脂質分子を固定化し、固定化した脂質分子をアンカーとして脂質膜と膜タンパク質を基板上で再構成する方法である。前者の方法では膜タンパク質の配向性と固定化密度を制御した生体膜の再構成ができ、後者では膜タンパク質の流動性を確保した生体膜の固定化が行え、それぞれ一長一短をもつ2つの固定化方法が確立できたと考えられ、今後いろいろな膜タンパク質の機能解析に適用されることが期待される。

The quality of the film is not easy to determine, but the quantitative analysis is easy to determine. In this study, the structure of analytical system for quantitative analysis of membrane and crystal oscillator was pointed out. The secretion of the lipid membrane is important to the development of the lipid membrane. TSecYE, TSecYE, TSecYE, TSecYE interaction analysis of the site-specific biotin and Avidin adsorption on the substrate of the crystal oscillator is carried out in the presence of highly thermophilic bacteria in the interface active agent. The result is that the TSecYE dimer state is 1:2. The TSecA strong interaction is 1:2. The TSecYE strong interaction is 1:2. To explore the method of immobilizing the lipid membrane on the substrate 1. A method for purifying the membrane from the surfactant, site-specific modification, immobilization of the modified site on a substrate, and replacement of the surfactant with a lipid membrane. 2. Immobilization of lipid molecules on a substrate. Immobilization of lipid molecules on a substrate. The former method is to control the orientation and immobilization density of the film quality, and the latter is to ensure the fluidity of the film quality. The immobilization method of the film quality is to be established. The future application of the immobilization method to the functional analysis of the film quality is expected.