グルタミン酸作動性付与因子・小胞型グルタミン酸輸送体の構造と機能に関する研究

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トポロジー解析:小胞型グルタミン酸トランスポーターのアミノ末端、カルボキシル末端及びループ領域に対する部位特異抗体を作成し、これを用いて膜内トポロジーを決定した。局在化機構解析:VGLUT2は発現する組織により細胞内局在が異なる。オルガネラへのターゲッティングの違いの原因として、VGLUT2のカルボキシル末端のリン酸化状態の違いを考えた。カルボキシル末端のリン酸化される可能性があるセリン及びチロシン残基のアラニン変異体をCOS7細胞に発現させたところ、Wild typeと同様の局在を示した。カルボキシル末端のリン酸化はターゲティングに重要ではないことがわかった。モチーフ検索により、中央のループ領域にDe-leucineモチーフ(D/EXXXLL)が含まれていることを見出した。De-leucineモチーフはアダプタータンパク質複合体のAP-3が結合し、タンパク質をリソソームに選択的に輸送する。今後、ジロイシンモチーフの欠失変異体および置換体のVGLUT2を発現させ、targetingへの影響を調べていきたい。骨組織におけるグルタミン酸シグナリングと生理的意義:骨組織にはグルタミン酸シグナリングを構成するさまざまなタンパク質が発現している。骨組織でのVGLUTの発現を調べた。破骨細胞にVGLUT1が発現し、しかもトランスサイトーシス小胞に局在していることを見出した。トランスサイトーシス小胞に濃縮されたグルタミン酸は骨基質分解産物とともに分泌された。RT-PCR法と免疫染色により破骨細胞にmGluR8が発現していることを見出した。分泌されたグルタミン酸はオートクリン的にmGluR8を介してトランスサイトーシスを抑制した。VGLUT1ノックアウトマウスでは骨量が減少していた。グルタミン酸シグナリングは骨吸収の抑制因子である。in vivoでグルタミン酸シグナリングの生理的意義が示された最初の例である。