DNA複製モニター機構の試験管内再構成

DNA复制监测机制的体外重建

• 批准号: 04J07840
• 负责人: 橋本 吉民
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J07840/
• 关键词: DNA複製チェックポイント; Cut5; TopBP1; ATR; Chk1; リン酸化; アフリカツメガエル; 卵無細胞複製系; ATR-Chk1経路; Dpb11; アフリカツメガエル無細胞複製系

DNA複製チェックポイントは、複製進行をモニターする機構であり、正常な複製進行が阻害されたときに、ATR-Chk1のキナーゼ経路を活性化し細胞周期のG2/M期への進行を抑制する。昨年度の研究では、アフリカツメガルCut5のN末端側領域が複製開始、C末端側領域がChk1活性化に機能することを明らかにした。本年度は、C末端側領域のATR-Chk1経路活性化における役割を明らかにすることを目的として研究を行った。ヒトCut5ホモログであるTopBP1は、C末端側領域内のATM/ATRファミリー標的配列(SQ/TQ)においてリン酸化を受けることが知られている。そこで、ツメガエルCut5も同様のリン酸化を受けるか検討した結果、複製阻害時にリン酸化されることを見い出した。このリン酸化部位をアラニンに置換した変異体Cut5は、複製開始には機能したが、複製阻害時のChk1活性化に異常が見られ、これはリン酸化を擬態したグルタミン酸置換体により回復した。これらの結果は、Cut5のC末端側領域のリン酸化がChk1活性化に必要であることを示唆している。また、ATR-Chk1経路の活性化にCut5が直接関与するかどうか検討するため、免疫沈降したATRを用いてキナーゼアッセイを行った結果、Cut5はATRによるChk1リン酸化を促進した。このとき、C末端領域内のリン酸化部位に対するアラニン置換体では促進活性がなく、グルタミン酸置換体には促進活性があった。これらの結果は、高等真核生物Cut5/TopBP1のC末端側領域は、メディエーターとしてATR-Chk1経路の活性化に直接関与し、その機能はATR/ATM依存的なリン酸化によって制御されることを示唆している。

DNA复制检查点是监测复制进程的机制，当抑制正常复制进程时，它们会激活ATR-CHK1的激酶途径，并抑制细胞周期到G2/M相的进展。去年的一项研究表明，切割5的N末端区域开始复制，C末端区域功能激活CHK1。今年，我们进行了一项研究，目的是阐明C末端区域在ATR-CHK1途径激活中的作用。已知TopBp1是一种人类Cut5同源物，在C末端区域内会在ATM/ATR家族目标序列（SQ/TQ）处进行磷酸化。因此，我们研究了爪蟾cut5是否经历了相似的磷酸化，并发现它在抑制复制后被磷酸化。突变体切割5在复制开始时用丙氨酸代替了该磷酸化位点，但是看到复制抑制后的异常CHK1激活，并且通过模仿磷酸化的谷氨酸替代来恢复。这些结果表明，CHK1激活需要Cut5的C末端区域的磷酸化。此外，为了研究Cut5是否直接参与ATR-CHK1途径的激活，我们使用免疫沉淀的ATR进行了激酶测定，发现Cut5通过ATR促进了CHK1磷酸化。目前，C末端区域的磷酸化位点的丙氨酸取代没有启动子活性，而谷氨酸取代具有启动子活性。这些结果表明，较高的真核切割5/topBP1的C末端区域直接参与ATR-CHK1途径作为介体的激活，其功能受ATR/ATM依赖性磷酸化的调节。