DNA複製モニター機構の試験管内再構成

DNA複製チェックポイントは、複製進行をモニターする機構であり、正常な複製進行が阻害されたときに、ATR-Chk1のキナーゼ経路を活性化し細胞周期のG2/M期への進行を抑制する。昨年度の研究では、アフリカツメガルCut5のN末端側領域が複製開始、C末端側領域がChk1活性化に機能することを明らかにした。本年度は、C末端側領域のATR-Chk1経路活性化における役割を明らかにすることを目的として研究を行った。ヒトCut5ホモログであるTopBP1は、C末端側領域内のATM/ATRファミリー標的配列(SQ/TQ)においてリン酸化を受けることが知られている。そこで、ツメガエルCut5も同様のリン酸化を受けるか検討した結果、複製阻害時にリン酸化されることを見い出した。このリン酸化部位をアラニンに置換した変異体Cut5は、複製開始には機能したが、複製阻害時のChk1活性化に異常が見られ、これはリン酸化を擬態したグルタミン酸置換体により回復した。これらの結果は、Cut5のC末端側領域のリン酸化がChk1活性化に必要であることを示唆している。また、ATR-Chk1経路の活性化にCut5が直接関与するかどうか検討するため、免疫沈降したATRを用いてキナーゼアッセイを行った結果、Cut5はATRによるChk1リン酸化を促進した。このとき、C末端領域内のリン酸化部位に対するアラニン置換体では促進活性がなく、グルタミン酸置換体には促進活性があった。これらの結果は、高等真核生物Cut5/TopBP1のC末端側領域は、メディエーターとしてATR-Chk1経路の活性化に直接関与し、その機能はATR/ATM依存的なリン酸化によって制御されることを示唆している。

DNA複製チェックポイントは、複製進行をモニターする機構であり、正常な複製進行が阻害されたときに、ATR-Chk1のキナーゼ経路を活性化し細胞周期のG2/M期への進行を抑制する。昨年度の研究では、アフリカツメガルCut5のN末端側領域が複製開始、C末端側領域がChk1活性化に機能することを明らかにした。本年度は、C末端側領域のATR-Chk1経路活性化における役割を明らかにすることを目的として研究を行った。ヒトCut5ホモログであるTopBP1は、C末端側領域内のATM/ATRファミリー標的配列(SQ/TQ)においてリン酸化を受けることが知られている。そこで、ツメガエルCut5も同様のリン酸化を受けるか検討した結果、複製阻害時にリン酸化されることを見い出した。このリン酸化部位をアラニンに置換した変異体Cut5は、複製開始には機能したが、複製阻害時のChk1活性化に異常が見られ、これはリン酸化を擬態したグルタミン酸置換体により回復した。これらの結果は、Cut5のC末端側領域のリン酸化がChk1活性化に必要であることを示唆している。また、ATR-Chk1経路の活性化にCut5が直接関与するかどうか検討するため、免疫沈降したATRを用いてキナーゼアッセイを行った結果、Cut5はATRによるChk1リン酸化を促進した。このとき、C末端領域内のリン酸化部位に対するアラニン置換体では促進活性がなく、グルタミン酸置換体には促進活性があった。これらの結果は、高等真核生物Cut5/TopBP1のC末端側領域は、メディエーターとしてATR-Chk1経路の活性化に直接関与し、その機能はATR/ATM依存的なリン酸化によって制御されることを示唆している。