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動物細胞ゲノムの複製機序とその破綻により働く機能的複製制御機構に関する研究

动物细胞基因组复制机制及其分解激活的功能复制控制机制研究

基本信息

批准号：
04J09589
负责人：
杉村和人
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Mie University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

DNAフアイバー上で未知の複製開始点を探索するために、標本DNAの変性無しでプローブDNAのハイブリダイゼーションが可能な、non-denaturing FISHを新規に開発した。これとin vivo複製標識法を用い、ヒト1番染色体q32領域内の特定領域(150-200kb)内に複製開始点が存在することを示すことができた。この手法により哺乳類染色体上の特定領域における複製開始点をDNA-分子上で解析することが可能となった。Topoisoraerase I阻害剤CPTによりDNA損傷を与えた時の複製フォーク進行制御機構を解析した。CPT処理により、複製フォークは有意に減速したが、poly(ADP-ribose)polymerase(PARP)を特異的阻害剤で処理すると、有意に回復した。また、PARP-1 siRNA処理細胞でも同様に、CRT処理により減速したフォークの速度は有意に回復した。さらに、PARP-1ノックアウトDT40細胞においてもCPT処理による複製フォークの減速がられなかった。また、DNA polymeraseβノックアウトDT40細胞ではフォークの減速が回復することは無かった。これら結果より、PARP-1はCPTによるDNA複製依存的DNA損傷に応答して複製フォークの進行を制御していることがわかった。転写調節因子ElonginAの欠損は、プログラム細胞死(アポトーシス)を引き起こす。その原因がDNA複製の異常に起因すると推測し、ElonginA欠損マウス由来胎児性繊維芽細胞を用いて、DNAファイバー法とin vivo複製鎖標識法を用いて複製フォークの進行速度を解析した。その結果、ElonginA欠損細胞では複製フォークの進行が停止または大きく遅延していることを見出した。このことから、ElonginA欠損による細胞死は、複製フォーク進行異常に由来すると結論づけた。

DNA replication start point is unknown, and new rules for DNA replication are developed. The replication start point exists in a specific domain (150-200kb) within chromosome q32. This technique allows for the initiation of replication in specific domains on mammalian chromosomes and for DNA-molecular analysis. Topoisoresterase I prevents DNA damage and replication by analyzing the mechanism for controlling DNA damage. CPT processing, replication, and intentional slowing down of poly(ADP-ribose)polymerase(PARP) is a specific process of blocking, and intentional recovery. PARP-1 siRNA-treated cells are slow, CRT treated cells are slow, and CRT treated cells are slow. PARP-1 can be used to slow down DT40 cells. DNA polymerase beta is the most potent enzyme in DT40 cells. As a result, PARP-1 is responsible for DNA replication-dependent DNA damage, and replication is controlled. Elongin A, a regulatory factor, plays an important role in the regulation of cell death. The causes of DNA replication abnormalities are presumed to be due to the use of DNA replication in vivo and the speed of replication in vivo. As a result, Elongin A failed to reproduce the original cell. The reason for this is that Elongin A is not damaged, the cell is dead, and the replication is abnormal.