AIDにおける構造機能連関の解析

AID中的结构-功能关系分析

• 批准号: 04J52602
• 负责人: 江藤 朋憲
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J52602/
• 关键词: AID; Apobec 1; CH12F3-2細胞; RNA編集活性; 抗体のクラススイッチ; 体細胞高頻度突然変異

我々の研究グループは、抗体のクラススイツチ及び体細胞高頻度突然変異の機構に必須であるAIDの機能解析を行うことで抗体分子の多様性が生み出される分子機構の解明を目指している。我々の研究からAIDはRNA編集活性として報告されているApobec1と相同性が高いためにAIDもRNA編集活性を有すると考えている。また、我々以外の研究グループらの大腸菌を用いた研究からAIDはDNA編集活性を有すると考えられている.しかし、実際にはAIDがどちらの活性を有しているのかは未だ明確ではない。そこで、マウスのB細胞リンパ腫由来の細胞株であるCH12F3-2細胞を用いてより生理的な条件に近い実験系を確立し、AIDがDNA編集活性を有するのかあるいはRNA編集活性を有するのかを明確にすることを試みた。そこで、CH12F3-2細胞に体細胞高頻度突然変異を検出する人工基質を安定に導入された細胞株を作成した。得られた細胞株にレトロウイルスによりタグ付きのAID、Apobec1を強制発現させ、体細胞高頻度突然変異が誘導されるかどうかを蛍光タンパク質の発現を指標として蛍光顕微鏡あるいはFACS解析により確認した。また、同様にB細胞株以外の細胞株NIH3T3細胞に体細胞高頻度突然変異を検出する人工基質を安定に導入された細胞株を作成し、得られた細胞株にレトロウイルスによりタグ付きのAID、Apobec1を強制発現させ、体細胞高頻度突然変異が誘導されるかどうかを蛍光タンパク質の発現を指標として蛍光顕微鏡あるいはFACS解析により確認した。また、AID、Apobec1のタンパク質の発現は付加したタグ特異的な抗体でWestern blotting法により確認した。これらの細胞を用いて研究を行ったところ、大腸菌を用いて得られている研究結果がそのまま哺乳類細胞では再現できなかったことを我々は示した。つまり、AIDがDNA編集活性を有するという考えには再考が必要であると示した。

Our research team believes that the functional analysis of AID is necessary for the rapid and sudden changes in the structure of antibodies and somatic cells, and the diversity of antibody molecules has led to an understanding of the molecular structure. Our study reported that Apobec1 identity was high in AID RNA assembly activity. In addition, the study of DNA editing activity in E. coli was carried out in the study of AID. In fact, the AID is not clear. CH12F3 -2 cells were used in the establishment of a near neutral lineage under physiological conditions, and DNA editing activity was identified. CH12 F3-2 cells were transformed into stable cells by artificial medium with high frequency of somatic mutation. The expression of Aids and Apobec1 in cell strains was detected by stress, and the expression of high frequency of somatic cell mutation was detected by FACS analysis. Cell line NIH3T3 cell line other than B cell line was induced by high frequency abrupt change of somatic cell, artificial matrix was stably introduced into cell line, cell line was prepared, cell line was obtained, cell line was induced by stress, AID, Apobec1 was induced by stress, cell line was induced by high frequency abrupt change of somatic cell, cell line was induced by stress, and cell line was induced by stress. The development of the protein and protein of AID and Apobec1 was confirmed by Western blotting. The results of this study on mammalian cells are shown in the following ways: The DNA editing activity of AID is necessary.