非天然型アミノ酸を利用した部位指定タンパク質1分子1蛍光標識法の開発

利用非天然氨基酸开发定点蛋白质单分子单荧光标记方法

基本信息

  • 批准号:
    15710148
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.92万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
  • 财政年份:
    2003
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2003 至 2004
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

今年度は、反応性を有するスクシイミドエステル基をもつトリアリルフォスフィン誘導体とアミノ基を有する各種蛍光物質とあらかじめ反応させることでアジド基修飾用トリアリルフォスフィン誘導体を調製し、その後アジド基を含むタンパク質と反応することを検討した。実際にはAlexa350、Alexa488、テトラメチルローダミンおよびAlexa648などの蛍光分子を有するトリアリールホスフィン誘導体を調製し、アジドチロシンを部位特異的に持つカルモデュリン(CaM)と反応させ、蛍光修飾を行った。各種蛍光標識が確認できたことから、目的に応じた官能基を有するトリアリールホスフィン誘導体の簡便な調製法が確立できたと考えられ、更なる有用性を持たせることができた。上記方法により調製した部特異的テトラメチルローダミン修飾CaMを用い、基質タンパク質との相互作用解析を行った。確認方法として、ゲルシフトアッセイ法、蛍光エネルギー移動の検出および1分子蛍光解析装置による解析の3種類により行った。前2つの解析方法では基質ペプチド融合蛍光タンパク質を利用し分子間相互作用の解析を行ったところ、ゲル移動度の違いが確認されたこと、また基質由来蛍光タンパク質から、CaMに導入した蛍光分子への蛍光エネルギー移動が確認できたことから相互作用が確認でき、今後これを利用した網羅的解析への第一歩を踏み出すことができた。また3つめの方法においてはCaM抗体を用いて解析を行ったところ非常に少量のサンプル量で解離常数を算出できたことから、今後の更なる展開が期待できる。
This year, there are various kinds of fluorescent substances, such as fluorescent substances, fluorescent substances, In fact, Alexa350, Alexa488, Alexa648, and Alexa648 have been used to modulate, degrade, and site-specific light molecules, such as CaM, CaM, and CaM. A simple method for determining the usefulness of various optical markers The above method is used to analyze the interaction between CaM and matrix. The method of identification, detection and analysis of molecular fluorescence analyzer are described in detail below. The first step of the analysis method is to identify the molecular interaction between the matrix and the light molecule, and to identify the molecular interaction between the matrix and the light molecule. The method of CaM antibody analysis is to calculate the dissociation constant of a small amount of CaM antibody, and to expand it in the future.

项目成果

期刊论文数量(1)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
ミトコンドリア蛋白質を用いる、非天然アミノ酸を蛋白質に部位特異的に導入する方法及びtRNAの効率的調整方法
一种在蛋白质中定点引入非天然氨基酸的方法以及利用线粒体蛋白质调节tRNA的有效方法
  • DOI:
  • 发表时间:
    2004
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
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  • DOI:
  • 发表时间:
    2004
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
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  • 通讯作者:
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  • 发表时间:
    2004
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
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    Kaname UMEJI;Osamu GOTO et al.;Osamu GOTO et al.;源 愛日児;大野 敏;源 愛日児;大野 敏
  • 通讯作者:
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  • DOI:
  • 发表时间:
    2004
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
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    Kaname UMEJI;Osamu GOTO et al.;Osamu GOTO et al.;源 愛日児;大野 敏;源 愛日児
  • 通讯作者:
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  • 资助金额:
    $ 1.92万
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  • 资助金额:
    $ 1.92万
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