ベラ科魚類の配偶行動の性転換に関わる脳内シグナル分子の探索

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本年度は、ホンベラの性転換に伴ってリン酸化または脱リン酸化される脳内タンパク質群の同定を目的として、以下の実験を実施した。(1)性転換前後でリン酸化状態が変化するタンパク質群の同定ホンベラを大量捕獲して、解剖によって性転換前の雌と性転換完了後の二次雄を区別した後、脳を採取した。脳からタンパク質を抽出した後、リン酸化タンパク質をアフィニティ精製し(QIAGEN社PhosphoProtein Purification Kitを使用)、17年度に確立した二次元HPLC分析系に供した。性転換前後のサンプルでクロマトグラムを比較したところ、大きな変化が認められるタンパク質ピークは見つからなかった。(2)バソトシン・イソトシン受容体cDNAのクローニング当初計画した方法では目的のタンパク質の発見に至らなかったので、リン酸化タンパク質の候補となりうる分子のcDNAクローニングを試みた。これまでの研究から、バソトシンとイソトシンの2つの脳内神経ペプチドと魚類の性転換との関連が示されている。多くの神経ペプチドの受容体がリガンドと結合するとリン酸化されることから、バソトシンとイソトシンの各受容体が性転換に伴ってリン酸化を受ける可能性が考えられた。そこで、この仮説を検証するため、ホンベラ脳からのバソトシン・イソトシン受容体のcDNAクローニングを実施した。他の脊椎動物で既にクローニングされているバソトシン・イソトシン受容体のアミノ酸配列を比較し、保存領域に対応するdegenerate primerを設計してRT-PCRを行ったところ、各受容体と高い相同性を示すPCR断片を得た。さらに、inverse PCRによって両受容体の全長の推定アミノ酸配列を明らかにした。今後は両受容体について、性転換前後のリン酸化状態の解析を進めていきたい。