葉緑体への蛋白質輸送における膜透過中間体の解析

葉緑体蛋白質の9割以上は細胞質で合成された後、葉緑体へ輸送される。この輸送過程において、前駆体と葉緑体包膜に存在する輸送因子であるToc(外包膜)/Tic(内包膜)複合体とが不可逆的に結合することにより初期膜透過中間体が形成される。本研究は初期膜透過中間体の形成から膜透過の完了に至るまでの前駆体蛋白質と輸送因子との逐次的相互作用を明らかにすることを目的としている。実験の第一段階として、実験系への夾雑物の持込を制御するためのリコンビナント蛋白質を用いたin vitro import assay系を構築していた(Inoue, et al., Plant Physiol. Biochem. 2008, in press))。次に、この実験系を利用して、これまでに初期膜透過中間体がGTP/ATPと温度に依存して少なくとも三つの段階に分けられることをこれまでに明らかにしてきた(Inoue and Akita, J. Biol. Chem. 2008 283, 7491-502)。更に、各段階における前駆体蛋白質と輸送因子との位置関係を、システインを移行シグナルに一個だけ導入した前駆体蛋白質と光反応性架橋剤(MBP:4-(N-Maleimido)benzophenone)を用いた部位特異的架橋法により解析を行った。その結果、複数の架橋産物が形成され、その中の1つは外包膜に存在しているToc75との架橋複合体であった。さらに、中間体の形成条件の違いにより、Toc75と移行シグナルとの架橋している位置が異なることを明らかにした(投稿中)。

葉緑体蛋白質の9割以上は細胞質で合成された後、葉緑体へ輸送される。この輸送過程において、前駆体と葉緑体包膜に存在する輸送因子であるToc(外包膜)/Tic(内包膜)複合体とが不可逆的に結合することにより初期膜透過中間体が形成される。本研究は初期膜透過中間体の形成から膜透過の完了に至るまでの前駆体蛋白質と輸送因子との逐次的相互作用を明らかにすることを目的としている。実験の第一段階として、実験系への夾雑物の持込を制御するためのリコンビナント蛋白質を用いたin vitro import assay系を構築していた(Inoue, et al., Plant Physiol. Biochem. 2008, in press))。次に、この実験系を利用して、これまでに初期膜透過中間体がGTP/ATPと温度に依存して少なくとも三つの段階に分けられることをこれまでに明らかにしてきた(Inoue and Akita, J. Biol. Chem. 2008 283, 7491-502)。更に、各段階における前駆体蛋白質と輸送因子との位置関係を、システインを移行シグナルに一個だけ導入した前駆体蛋白質と光反応性架橋剤(MBP:4-(N-Maleimido)benzophenone)を用いた部位特異的架橋法により解析を行った。その結果、複数の架橋産物が形成され、その中の1つは外包膜に存在しているToc75との架橋複合体であった。さらに、中間体の形成条件の違いにより、Toc75と移行シグナルとの架橋している位置が異なることを明らかにした(投稿中)。