プレニルトランスフェラーゼの構造機能相関と代謝工学への応用

异戊烯基转移酶的构效关系及其在代谢工程中的应用

• 批准号: 05J02011
• 负责人: 小原 一朗
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J02011/
• 关键词: プレニルトランスフェラーゼ; 膜タンパク質; 代謝工学

p-ヒドロキシ安息香酸(PHB)プレニルトランスフェラーゼ(PPT)ファミリーの酵素機能を解明するため、昨年度はLithospermum erythrorhizon p-hydroxybenzoic acid geranyltransferase(LePGT)をモデルにして、分子内に存在する三カ所の高保存領域(R-(x)_5-N-(x)_3-D-(x)_4-R-(x)_3-RP、W-(x)_4-DxxY-(x)_3-D-(x)_3-D-(x)_6-S)及びY-(x)_3-KRへ部位特異的変異導入を行った。各変異酵素を酵母をホストとした発現系に導入発現させ、酵素活性を測定を測定したところ、PPTファミリーの酵素活性において中心的な役割を担っているのが、高保存領域中の高度に保存されたアスパラギン酸残基(D87、D91、D208)であることを明らかにできた。これらの部位特異的変異導入酵素に加えて、プレニル基質としてGPPに高い特異性を示すLePGTと、長鎖のプレニル二リン酸を基質にできる大腸菌のユビキノン生合成系のUBIAとのキメラ酵素を7種類作成し、酵素活性測定、並びに酵母によるユビキノン生成を指標とした相補試験を行った。その結果、両酵素のプレニル基質特異性の相違がN末端側の領域に由来することを明らかとした。またキメラ酵素の基質に対するKm値などの生化学的データから、N末端領域のアミノ酸が直接プレニル二リン酸との結合に寄与していることが示唆された。一方で、結合型プレニル転移酵素の構造生物学的解析を目指したLePGTの大量発現系及び精製条件の検討も行い、昆虫細胞をホストに用いてC末端にHis-tagを付与したLePGTを大量発現させ、発現した組み換えLePGTの界面活性剤による可溶化の最適化、Ni-NTAアガロースを用いたアフィニティー精製条件の最適化を行い、酵素活性を保ったままCBB染色レベルでほぼ単一のバンドにまで精製することに成功した。本年度は、この精製酵素を用いて、酵素機能のキャラクタライズを行った。その結果、精製LePGTは可溶化などの精製ステップにより、その酵素化学的性質に大きな変化を受けていないことを確認した。以上のように本年度はLePGTとUBIAとのキメラ酵素の作成とその解析によりプレニル基質の鎖長を認識する領域を明らかにするとともに、立体構造解明にむけた精製LePGTの基礎的な酵素化学的データの蓄積を行った。

p-hydroxybenzoic acid geranyl transferase (LePGT) is a highly conserved domain (R-(x)_5-N-(x)_3-D-(x)_4-R-(x)_3-RP) that exists in the molecular structure of Lithospermum erythrorhizon. W-(x)_4-DxxY-(x)_3-D-(x)_3-D-(x)_6-S and Y-(x)_3-KR site-specific variant introductions were performed. The enzyme activity of the yeast was determined by enzyme activity determination. The enzyme activity was determined by enzyme activity determination. The enzyme activity was determined by enzyme activity determination. The enzyme activity was determined by enzyme activity determination. This site-specific enzyme is introduced into the substrate and GPP. The specificity of the enzyme is shown in LePGT and long-chain enzyme. The enzyme activity of UBIA in Escherichia coli production system is determined by enzyme activity and yeast production index. As a result, the enzyme's substrate specificity is incompatible with the origin of the N-terminal domain. The Km value of the substrate of the enzyme is higher than that of the biochemical substrate, and the N-terminal substrate is higher than that of the direct substrate. The structural biology analysis of a binding type of PGT enzyme indicates that the mass production system and purification conditions of LePGT are discussed. The His-tag is assigned to the C-terminal of the insect cell. The mass production of LePGT is optimized. The solubility of the interfacial active agent of LePGT is optimized. The purification conditions of Ni-NTA are optimized. The enzyme activity was maintained and CBB staining was performed successfully. This year, we will continue to improve the quality of our products. As a result, purified LePGT is soluble, purified and chemically characterized. This year's LePGT enzyme production and analysis, three-dimensional structure analysis, purification of LePGT basic enzyme production

项目成果

Functional characterization of OsPPT1, which encodes p-hydroxybenzoate polyprenyltransferase involved in ubiquinone biosynthesis in Oryza sativa

• DOI: 10.1093/pcp/pcj025
• 发表时间: 2006-05-01
• 期刊: PLANT AND CELL PHYSIOLOGY
• 影响因子: 4.9
• 作者: Ohara, Kazuaki;Yamamoto, Kyoko;Yazaki, Kazufumi
• 通讯作者: Yazaki, Kazufumi