細胞内遺伝子検出システムを用いる薬剤高速スクリーニング系の構築

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細胞適合性を有し、リアルタイムな遺伝子発現解析が可能な遺伝子検出法の構築を新たな課題として、特定核酸配列結合型蛍光分子の開発と遺伝子検出への応用を試みた。DNA、RNAを選択的に染色する膜透過性蛍光色素は多く知られている。従来用いられてきた核酸選択的蛍光色素を改変し、より高次な核酸の"特定配列/構造"に結合した揚合にのみ蛍光を発する機能性蛍光分子の開発を行った。天然型核酸プローブと蛍光色素が独立した遺伝子検出系を構築出来れば、細胞内での応用を容易にするのみでなく、コスト面でも有利である。具体的には、よく知られる蛍光核染色剤Hoechstの合成ルートを検討し、Hoechst類似体ライブラリを作成した。分光学的、熱力学的評価を行い、ライブラリの中から蛍光性を維持しながらも、B型DNAには結合しないHoechst誘導体の探索に成功した。次に、SELEX法を用いて、Hoechst誘導体.に特異的に結合し蛍光発光を誘起するDNA配列(DNA-aptamer)の選抜を実施した。選抜してきたDNA-aptamerを加えたところ、Hoechst誘導体は200倍近くの蛍光増幅が観測され、特定DNA配列/構造に結合した場合にのみ蛍光を発する新たなLight-Up蛍光色素/DNA-aptamerペアの探索に成功したことが示された。得られたDNA-aptamerを、loop部位で2つに分割し、夫々に標的配列と相補的な配列の結合部位を持たせたbinary probeを作成した。binary probeとHoechst誘導体を系中に含ませ、標的配列存在下、及び非存在下において蛍光発光を観測すると135倍程度のIon/loffを示し、さらに、本系が1塩基識別可能であることも確認している。同様にして、Hoechst誘導体に特異的に結合し蛍光発光を誘起するRNA-aptamerの選抜を実施し、特定RNA配列/構造に結合した場合にのみ蛍光を発する新たなLight-up蛍光色素/RNA-aptamerペアの探索にも成功している。得られたRNA-aptamer配列を融合させたmRNAを転写することにより、目的とするmRNAの転写モニタリングが可能であることを確認している。