蛍光性核酸塩基検出試薬を利用した簡素な一塩基多型検出法の開発と応用

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DNA中の一塩基多型の新たな検出方法として、所属研究グループでは脱塩基部位(AP site)含有DNAプローブと蛍光性小分子リガンドを併用する検出法を提案している。本年度は、疎水場蛍光プローブであるDBD(7-N, N-Dimethylaminosulfonylbenzo-2-oxa-1,3-diazole)をAMND(2-Amino-7-methyl-1,8-naphthyridine)に導入したリガンドを新規に開発した。このリガンドとAP site含有DNA二重鎖との相互作用を評価したところ、ターゲット塩基がシトシン、チミンの場合にDBDが著しい蛍光発光応答を示した。またこれにピリミジン塩基に対して蛍光消光応答を示すAMND部位の応答を組み合わせ、蛍光強度に応じた擬似カラー表示による蛍光レシオ検出を行ったところ、ピリミジン塩基とプリン塩基の明瞭な視覚的判別が可能であった。このDBDの発蛍光応答は、DBD部位周辺の疎水性の増加によるものと考えられる。すなわち、ターゲット塩基がピリミジン塩基の場合には、AMND部位がAP site内で塩基を認識するのに伴い、DBD部位がDNA二重鎖の疎水場である副溝に位置するという仕組みである。そこで、DBDの蛍光ストークスシフトの変化からLippert-Matagaの式等を利用してこの場合のリガンドのDBD部位周辺の誘電率を調べた結果、副溝に位置していることを示唆する値を示した。さらに、DNA二重鎖に比べて副溝の疎水性が低いDNA-RNA二重鎖にこのリガンドを適用したところ、DBDの発光応答は減少し、DBD部位が副溝側に位置していることを示す結果を得た。また、表面プラズモン共鳴を利用する検出法について、最適な測定条件を検討し、PCR産物に対する検出への応用を行った。その結果、107merDNA中の一塩基変異の明瞭な検出を達成した。