消化器癌の発生に関わるヘッジホッグ経路のエピジェネティクな制御機構の解析

1)消化器癌細胞株におけるSonic Hedgehog ; ShhおよびShhシグナル経路の発現検討RT-PCRによりShhおよびShhシグナル分子のmRNAを、またShhに対する特異的抗体を用いたWestern blot法および免疫染色法によりタンパク質の発現を解析したところ、多くの細胞株でShhやそのシグナル経路の発現を認めた。2)Shh過剰発現による細胞制御機構の解析ShhをPCR法にてクローニングし、Shh発現ベクターを作成した。各種消化器癌細胞株にShh発現ベクターを遺伝子導入し、細胞形態や細胞増殖能の変化を観察したところ、明らかな変化は認められなかった。3)Shhのプロモーター領域の解析Shhのプロモーター領域の配列をゲノムよりPCR法にてクローニングした。消化器癌にて高発現がみられるクロマチン結合因子のShhプロモーターへの結合性を、in vitroにおいてバンドシフト法で、in vivoにおいてクロマチン免疫沈降で検出した。またShhのプロモーター領域を含むルシフェラーゼベクターを作成し、ルシフェラーゼアッセイによりそのプロモーター活性を検出した。4)クロマチン結合因子とShh発現量の関連性消化器癌細胞株においてクロマチン結合因子をsiRNA導入によりノックダウンし、特異的抗体を用いたWestern blot法によりそのノックダウン効果を定量した。さらにクロマチン結合因子ノックダウンによるShh発現量の変化をreal time RT-PCRや特異的抗体を用いたWestern blot法により定量したところ一部に変化がみられた。

1)消化器癌細胞株におけるSonic Hedgehog ; ShhおよびShhシグナル経路の発現検討RT-PCRによりShhおよびShhシグナル分子のmRNAを、またShhに対する特異的抗体を用いたWestern blot法および免疫染色法によりタンパク質の発現を解析したところ、多くの細胞株でShhやそのシグナル経路の発現を認めた。2)Shh過剰発現による細胞制御機構の解析ShhをPCR法にてクローニングし、Shh発現ベクターを作成した。各種消化器癌細胞株にShh発現ベクターを遺伝子導入し、細胞形態や細胞増殖能の変化を観察したところ、明らかな変化は認められなかった。3)Shhのプロモーター領域の解析Shhのプロモーター領域の配列をゲノムよりPCR法にてクローニングした。消化器癌にて高発現がみられるクロマチン結合因子のShhプロモーターへの結合性を、in vitroにおいてバンドシフト法で、in vivoにおいてクロマチン免疫沈降で検出した。またShhのプロモーター領域を含むルシフェラーゼベクターを作成し、ルシフェラーゼアッセイによりそのプロモーター活性を検出した。4)クロマチン結合因子とShh発現量の関連性消化器癌細胞株においてクロマチン結合因子をsiRNA導入によりノックダウンし、特異的抗体を用いたWestern blot法によりそのノックダウン効果を定量した。さらにクロマチン結合因子ノックダウンによるShh発現量の変化をreal time RT-PCRや特異的抗体を用いたWestern blot法により定量したところ一部に変化がみられた。