好熱性放線菌アミラーゼのデンプン結合ドメインと触媒活性・基質特異性との関係

嗜热放线菌淀粉酶淀粉结合域与催化活性和底物特异性的关系

• 批准号: 05J06519
• 负责人: 安部 暁美
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kagawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J06519/
• 关键词: α-アミラーゼ; デンプン結合ドメイン; X線結晶解析; 構造生物学; 多糖加水分解酵素; プルラン

好熱性放線菌α-アミラーゼ1(TVA1)は、ドメインNに2箇所の基質結合部位(Site-NA、Site-N)をもつ。これらの部位の役割を調べるため、基質の結合に関与する2つのトリプトファン(Trp51:Site-NA、Trp65:Site-N)をリジンに置換した3種類の変異体、W51K、W65K、W51K/W65Kを作成し、これら3種の変異TVA1と野生型TVA1を用いて、可溶性、不溶性デンプンを基質とした分子動力学的パラメータを測定した。可溶性デンプンを基質とした場合では、活性の違いは見られなかった。一方で不溶性デンプンを基質とした場合では、W51K/W65KのKmは野生型の20倍となった。さらに結合実験を行ったこところ、基質が高濃度になると野生型とW51Kはほぼ100%基質に結合するのに対し、W65KとW51K/W65Kでは約80%が結合するにとどまった。酵素の50%が結合するときの基質の濃度をK50としてKmと比較したところ、Km/K50の値(括弧内の数値)は小さい順に、野生型(2.5)、W65K(3.5)、W51K(3.9)、W51K/W65K(36)となった。以上の実験結果から、TVA1のドメインNは、デンプン結合ドメインとして、特に不溶性デンプンの加水分解において役立っており、Site-NAとSite-Nは不溶性デンプンを結合し、さらに基質を活性部位にうまく導いているのではないかと考えられた。それぞれの部位の役割は、Site-Nは不溶性デンプンへの結合、Site-NAは加水分解されやすいように基質を結合、という働きがわずかに優れているようではあるが、W51KとW65KでKmとK50、Vmaxがあまり変わらないことから、これら2つの部位の役割はそれぞれの部位が分業しているのではなく、それぞれが請け負ってお互いを補っているものと考えられた。

A thermophilic actinomycete α-1(TVA1) The site of TVA1 and the wild type TVA 1 were modified, the binding of TVA 1 to TVA 1 was determined, and the binding of TVA 1 to TVA 1 to TVA1 was determined. Soluble matrix, active matrix, active matrix A single insoluble matrix is 20 times higher than the wild type at W51K/W65 K. W51K/W65 K is about 80% bound to the substrate. 50% of enzyme binding to substrate concentration K50: Km: Km: Km/K50: Km: Km/K50: Km/Km: Km/K50: Km/Km: Km/Km/ The above results show that TVA1 has a combination of TVA1 and TVA1. The combination of TVA1 and TVA 1 has a combination of TVA 1 and TVA 1. The combination of TVA 1 and TVA 1 has a combination of TVA 1 and TVA 1. For example, if you want to use the site, you can use the Site-N to combine with the Site-NA. If you want to use the Site-NA to combine with the Site-NA, you can use the Site-NA to combine with the Site-NA. If you can use the Site-NA to combine with The two of them are in the middle of the game.

项目成果

Complexs of Thermoactinomyces vulgaris R-47 α-amylase 1 and pullulan model oligosaccharides provide new insight into the mechanism for recongnizing substrates with α-(1,6) glycosidic linkages

热放线菌 R-47 α-淀粉酶 1 和支链淀粉模型寡糖的复合物为识别具有 α-(1,6) 糖苷键的底物机制提供了新的见解

• 发表时间: 2005
• 期刊: FEBS Journal 272
• 作者: 藤井ゆき;犬塚美輪;犬塚 美輪;犬塚 美輪;犬塚 美輪;山中仁美;安部暁美
• 通讯作者: 安部暁美