スーパースピードコンジェニック法の新展開

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これまでの申請者らの知見で、インプリント遺伝子のDNAメチル化は卵母細胞のサイズに依存して確立していくこと、この卵子特異的なDNAのメチル化が受精後の正常な個体発生に必須であることが示されてきている。そのため、ゲノミックインプリンティングの確立に不可欠なDNAメチル基転移酵素遺伝子、Dnmt3aやDnmt3Lをゲノミックインプリンティングの確立していない未成長な卵母細胞で強制発現させることができれば、単為発生動物の生産も含め、非常に有効な生殖細胞利用技術になるものと考えられた。そこで本研究では、GFPをレポーター遺伝子として構築された発現ベクターを用い、エレクトロポーレーション法による新生仔非成長期卵母細胞への遺伝子導入を試みた。エレクトロポーレーションによる非成長期卵母細胞の発現ベクター導入効率および細胞生存率は、電気刺激の条件、緩衝液の種類および細胞濃度の3要因によって影響を受けた。エレクトロポーレーション時の細胞濃度は、5.0〜10.0×10^5個/100μlが最も良かった。また、22種類の電気刺激プログラムを試験したところ、最も良い条件では、導入効率2.6%および生存率20.9%となり、卵母細胞に導入されたGFPは、1週間以上強発現し続けた。しかし、NIH3T3などの体細胞株における遺伝子導入効率や生存率は共に80%以上と生殖細胞に比べて格段に高かった。次いで、GFPの下流にIRES配列とDnmt3Lを挿入した発現ベクターを構築し、エレクトロポーレーションにより卵母細胞への導入を試みた。その結果、GFPを指標とした導入効率は顕著に低下したが、導入処理後の遺伝子発現解析をRT-PCRにより行ったところ、外来性Dnmt3Lの発現が認められた。今後は非成長期卵母細胞におけるDnmt3L強制発現が、卵子特異的なDNAメチル化の早期誘導を可能にするか否か検証したい。